miRNA调控类腺相关病毒构建与包装

腺相关病毒（AAV）是一种复制缺陷型细小病毒，其增殖复制需要腺病毒或单纯疱疹病毒的辅助。AAV 无辅助病毒系统（AAV Helper-Free System）可以在无辅助病毒的条件下生产出重组人腺相关病毒。这种系统利用已经明确与调节AAV复制和表达的腺病毒基因产物，并且将这些基因产物通过转染引进宿主细胞，在AAV Helper-Free System中，生产感染性的AAV病毒颗粒所需的腺病毒基因产物（例如：E2A, E4和VA RNA基因）大部分由与其他质粒共转染进细胞的pHelper 质粒提供，其余的腺病毒基因产物由稳定表达腺病毒E1基因AAV-293宿主细胞提供。AAV-293细胞是经过改良HEK293腺相关病毒生产能力而衍生出的亚克隆细胞系。
野生型AAV 基因组由病毒rep和cap基因（分别编码和复制基因）及位于两侧的表达和包装必须的顺式作用元件—反向末端重复序列（Inverted Terminal Repeats, ITRs）组成。在AAV Helper-Free System中，rep和cap基因从病毒载体中被转移到辅助质粒pAAV-RC中， AAV ITRs仍位于病毒载体中，实际上在辅助质粒的帮助下，仅需两端的 ITR就能将携带的外源片段包装进入腺相关病毒颗粒。Rep和Cap基因的转移后空出的位置是允许外源基因插入病毒基因组中的最大限度。
rAAV是基因传递和表达的一个重要工具。AAV具有广泛的宿主范围，高滴度病毒生产能力和长期的基因转染潜力的特征。AAV具有广泛的细胞核组织感染能力，并且不依赖于宿主细胞活跃的分裂能力。另外，由于这种系统不包含任何野生型病毒产品，宿主细胞免疫反应被降至最低，从而允许对具有免疫能力的宿主细胞进行基因传递。对于哺乳动物细胞基因传递策略，高滴度的重组病毒生产能力必须要顾及的。
AAV感染／转导过程可分为七个阶段，即： (1)AAV与受体的结合，(2)病毒颗粒的内摄， (3)囊泡的运输， (4)内涵体的脱离， (5)核转运， (6)病毒脱壳， (7)中间体双链DNA的合成。目前认为，AAV的细胞内转运和双链DNA合成是限制AAV感染效率的丰要因素。
腺相关病毒应用优势：

具有较高的生物安全级别
腺相关病毒（AAV）是一种复制缺陷型细小病毒，其感染需要腺病毒或疱疹病毒的辅助，并且目前尚未发现其和任何的人类疾病有关联。同时，在我们的生产的病毒载体中，AAV 反向重复（ITR）序列和rep/cap基因分别位于缺少共同序列的单独的质粒上，从而阻止生产出重组野生型病毒。
宿主细胞范围广
腺相关病毒可感染广泛的哺乳动物细胞，同时其不仅可感染分裂细胞，而且可感染非分裂细胞。与其它病毒载体相比，用于具有免疫活性细胞的基因表达时，腺相关病毒载体效果更好。
物理性质稳定
AAV可保存在常温且其滴度变化极小，同时在60℃都不能被灭活，甚至有文献报道用氯仿均不能灭活AAV。如此稳定的物理性质，相对于其他种类病毒，使得AAV在日常保存及运输中具有极大优势。
低免疫原性
与已获得临床应用的腺病毒载体相比，AAV 在注射后引起的免疫反应短暂。大剂量全身性特别是尾静脉使用虽然也会导致抗体的产生，但很少有感染上的细胞之后被细胞免疫系统所清除，这被认为与AAV对抗体递呈细胞感染较弱相关。
良好的扩散性
AAV颗粒较小，其粒径是腺病毒的 1/5，慢病毒的 1/4，体积上相差数十倍到100倍，所以 AAV的扩散性远高于这两种病毒。实践已证明，9 型AAV可透过血脑屏障感染神经元和胶质细胞。同时，AAV 用于局部感染肌肉、脑、眼，肝，肾等组织时，重复感染效率较好，这种特性在动物实验中优势明显。
长期稳定的基因表达能力
重组AAV感染细胞后，不会整合到基因组，而是串联形成附加体存在于细胞核中，从而保持长期稳定的基因表达，这对于终末分化的细胞该优点特别明显。
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