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诺赛基因
环形RNA（circRNA）是一类特殊的非编码RNA分子，也是RNA领域最新的研究热点。与传统的线性RNA（linear RNA，含5’和3’末端）不同，circRNA分子呈封闭环状结构，不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解。在功能上，近年的研究表明，circRNA分子富含microRNA（miRNA）结合位点，在细胞中起到miRNA海绵（ miRNA sponge）的作用，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表达水平；这一作用机制被称为竞争性内源RNA（ceRNA）机制。通过与疾病关联的miRNA相互作用， circRNA在疾病中发挥着重要的调控作用。
送样要求：
样本类型：RNA样本
样本量（一次）：人、鼠和大鼠：≥10 ug
样本浓度：人、大鼠、小鼠：≥65 ng/ul；
样品纯度：真核：OD260/280=1.8~2.2；OD260/230≥2.0； RIN≥7.0（动物），28S/18S≥1.0；
测序策略及数据量：
测序策略：PE125 / PE150 / PE250
数据量：一般测序8~10Gb
案例分析1：
对转基因水稻的研究发现对照组相比环形RNA的过表达能够降低亲本基因的表达水平，揭示了环形RNA与其线性形式是以负调节物的形式存在的。
图1：水稻中环形RNA的确定和分类。A确定circRNA的流程图。B敏感性和错误发现率的估算。C水稻叶片和花穗中检出的有PolyA和没有PolyA的样品的circRNA的韦恩图。D水稻的环形RNA的基因组的起源。
图2：环形RNA “Os08circ16564”在转基因水稻中的过表达分析。（A）环形RNA （Os08circ16564）的环形结构及亲本基因（AK064900）的可视化。（B）Os08circ16564的过表达及空载体转基因的qRT-PCR的结果。（C）qRT-PCR结果显示Os08circ16564的亲本基因AK064900在水稻叶片和花穗中的表达水平与空载体转基因植物相比有明显下降。（D）叶片和花穗中的转基因和空载体转基因DEGs的功能分类。
案例分析2：
为系统研究环形RNA的功能，对人，小鼠以及线虫的RNA进行了序列测定和深入分析。我们检测获得上千种表达很好的、稳定的环形RNA，它们通常具有组织或发育阶段的特异性表达。序列分析表明环形RNA具有重要的调控作用。我们发现，一种人类的环形RNA，与小脑变性相关蛋白-1的转录物（CDR1as）呈反义，被大量微RNA（miRNA）效应因子复合物结合，它含有67个可以与古老的微RNAmiR-7结合的位点。进一步的分析指出，CDR1as在神经组织中与miR-7结合。在斑马鱼中表达人的CDR1as会破坏中脑的发育，与miR-7的缺失相似，说明CDR1as是一种miRNA的拮抗剂，其结合miRNA的能力比其他已知的转录物高10倍。综上，我们的数据提供了证据证明环形RNA形成了具有转录后调节功能的一大类物质。
图3：环状RNA的检测，分类以及进化保守性。a，跨越剪接点的阅读边界与基因组的序列对比，上半部分是线性的，下半部分是反方向头对尾的剪接后阅读。剪接后阅读一定要与锚点对齐，两侧是AG/GU。b，人体细胞中的环状RNA；c，线虫发育中的环状RNA；d，人环状RNA起源。
案例分析3：
科研人员通过对果蝇大量的RNA测序数据的分析，注释了2500多个环形RNA，并进一步确定了其结构及序列特征。通过分析了环形RAN的形成以及组织特异性，发现其在神经组织中有大量累积即更倾向于由神经基因产生。有趣的是，随着年龄的增加，这些环形异构体与线性异构体相比数量有大幅度的增加，这提示我们环形RNA可以作为一种年龄的生物标记物。
图4：果蝇环形RNA的注释和实例。（A）来自于scro.的环形外显子的实例。（B）能和reads相匹配、推测的无序的基因组连接的所有位点的分析。（C）基因中的环形RNA的分布。（D）相对于整体拼接的reads中从后面拼接的reads部分。（E）环化的外显子的多样性举例。（F）基于基因基础上的保护的评估。
图5：miRNA与环形RNA的结合位点。（A）一个来自于musclblind（mbl）的高表达的环形RNA。（B）果蝇中保守的miRNA的结合位点与环形RNA的编码区的定位。（C）一个编码的环形RNA的例子，该RNA包含有高度保守的miR-190的结合位点。（D）在环化过程中非常保守的miRNA与线性编码区之间，非常保守的2-8个种子序列匹配密度的比较。
参考文献：
1. Memczak S, Papavasileiou P, Peters O, Rajewsky N. Identification and Characterization of Circular RNAs As a New Class of Putative Biomarkers in Human Blood. PLoS One. 2015 Oct 20;10(10).
2. Zhang C, Wu H, Wang Y, Zhao Y, Fang X, Chen C, Chen H. Expression Patterns of Circular RNAs from Primary Kinase Transcripts in the Mammary Glands of Lactating Rats.J Breast Cancer. 2015 Sep;18(3):235-41.
3. Wang YH, Yu XH, Luo SS, Han H. Comprehensive circular RNA profiling reveals that circular RNA100783 is involved in chronic CD28-associated CD8(+)T cell ageing.Immun Ageing. 2015 Oct 8;12:17.
4. Boeckel JN, Jaé N, Heumüller AW, Chen W, Boon RA, Stellos K, Zeiher AM, John D, Uchida S, Dimmeler S.Identification and Characterization of ypoxia-Regulated Endothelial Circular RNA.Circ Res. 2015 Oct 23;117(10):884-90.
5. Xu H, Guo S, Li W, Yu P.The circular RNA Cdr1as, via miR-7 and its targets, regulates insulin transcription and secretion in islet cells.Sci Rep. 2015 Jul 27
6. Jakub O.W. Pedro Miura, Brenton R.G, et al. Genome-wide Analysis of Drosophila Circular RNAs Reveals Their Structural and Sequence Properties and Age-Dependent Neural Accumulation. Cell Reports. 2014 Dem 11(9)1966-1980
7. Lu TT, Cui LL, Zhou Y, Zhu CR, Fan DL,Gong H, Zhao Q, Zhou CC, et al. Transcriptome- wide investigation of circular RNAs in rice.2015 Oct 14
送样要求：
样本类型：RNA样本
样本量（一次）：人、鼠和大鼠：≥10 ug
样本浓度：人、大鼠、小鼠：≥65 ng/ul；
样品纯度：真核：OD260/280=1.8~2.2；OD260/230≥2.0； RIN≥7.0（动物），28S/18S≥1.0；
测序策略及数据量：
测序策略：PE125 / PE150 / PE250
数据量：一般测序8~10Gb
案例分析1：
对转基因水稻的研究发现对照组相比环形RNA的过表达能够降低亲本基因的表达水平，揭示了环形RNA与其线性形式是以负调节物的形式存在的。
图1：水稻中环形RNA的确定和分类。A确定circRNA的流程图。B敏感性和错误发现率的估算。C水稻叶片和花穗中检出的有PolyA和没有PolyA的样品的circRNA的韦恩图。D水稻的环形RNA的基因组的起源。
图2：环形RNA “Os08circ16564”在转基因水稻中的过表达分析。（A）环形RNA （Os08circ16564）的环形结构及亲本基因（AK064900）的可视化。（B）Os08circ16564的过表达及空载体转基因的qRT-PCR的结果。（C）qRT-PCR结果显示Os08circ16564的亲本基因AK064900在水稻叶片和花穗中的表达水平与空载体转基因植物相比有明显下降。（D）叶片和花穗中的转基因和空载体转基因DEGs的功能分类。
案例分析2：
为系统研究环形RNA的功能，对人，小鼠以及线虫的RNA进行了序列测定和深入分析。我们检测获得上千种表达很好的、稳定的环形RNA，它们通常具有组织或发育阶段的特异性表达。序列分析表明环形RNA具有重要的调控作用。我们发现，一种人类的环形RNA，与小脑变性相关蛋白-1的转录物（CDR1as）呈反义，被大量微RNA（miRNA）效应因子复合物结合，它含有67个可以与古老的微RNAmiR-7结合的位点。进一步的分析指出，CDR1as在神经组织中与miR-7结合。在斑马鱼中表达人的CDR1as会破坏中脑的发育，与miR-7的缺失相似，说明CDR1as是一种miRNA的拮抗剂，其结合miRNA的能力比其他已知的转录物高10倍。综上，我们的数据提供了证据证明环形RNA形成了具有转录后调节功能的一大类物质。
图3：环状RNA的检测，分类以及进化保守性。a，跨越剪接点的阅读边界与基因组的序列对比，上半部分是线性的，下半部分是反方向头对尾的剪接后阅读。剪接后阅读一定要与锚点对齐，两侧是AG/GU。b，人体细胞中的环状RNA；c，线虫发育中的环状RNA；d，人环状RNA起源。
案例分析3：
科研人员通过对果蝇大量的RNA测序数据的分析，注释了2500多个环形RNA，并进一步确定了其结构及序列特征。通过分析了环形RAN的形成以及组织特异性，发现其在神经组织中有大量累积即更倾向于由神经基因产生。有趣的是，随着年龄的增加，这些环形异构体与线性异构体相比数量有大幅度的增加，这提示我们环形RNA可以作为一种年龄的生物标记物。
图4：果蝇环形RNA的注释和实例。（A）来自于scro.的环形外显子的实例。（B）能和reads相匹配、推测的无序的基因组连接的所有位点的分析。（C）基因中的环形RNA的分布。（D）相对于整体拼接的reads中从后面拼接的reads部分。（E）环化的外显子的多样性举例。（F）基于基因基础上的保护的评估。
图5：miRNA与环形RNA的结合位点。（A）一个来自于musclblind（mbl）的高表达的环形RNA。（B）果蝇中保守的miRNA的结合位点与环形RNA的编码区的定位。（C）一个编码的环形RNA的例子，该RNA包含有高度保守的miR-190的结合位点。（D）在环化过程中非常保守的miRNA与线性编码区之间，非常保守的2-8个种子序列匹配密度的比较。
参考文献：
1. Memczak S, Papavasileiou P, Peters O, Rajewsky N. Identification and Characterization of Circular RNAs As a New Class of Putative Biomarkers in Human Blood. PLoS One. 2015 Oct 20;10(10).
2. Zhang C, Wu H, Wang Y, Zhao Y, Fang X, Chen C, Chen H. Expression Patterns of Circular RNAs from Primary Kinase Transcripts in the Mammary Glands of Lactating Rats.J Breast Cancer. 2015 Sep;18(3):235-41.
3. Wang YH, Yu XH, Luo SS, Han H. Comprehensive circular RNA profiling reveals that circular RNA100783 is involved in chronic CD28-associated CD8(+)T cell ageing.Immun Ageing. 2015 Oct 8;12:17.
4. Boeckel JN, Jaé N, Heumüller AW, Chen W, Boon RA, Stellos K, Zeiher AM, John D, Uchida S, Dimmeler S.Identification and Characterization of ypoxia-Regulated Endothelial Circular RNA.Circ Res. 2015 Oct 23;117(10):884-90.
5. Xu H, Guo S, Li W, Yu P.The circular RNA Cdr1as, via miR-7 and its targets, regulates insulin transcription and secretion in islet cells.Sci Rep. 2015 Jul 27
6. Jakub O.W. Pedro Miura, Brenton R.G, et al. Genome-wide Analysis of Drosophila Circular RNAs Reveals Their Structural and Sequence Properties and Age-Dependent Neural Accumulation. Cell Reports. 2014 Dem 11(9)1966-1980
7. Lu TT, Cui LL, Zhou Y, Zhu CR, Fan DL,Gong H, Zhao Q, Zhou CC, et al. Transcriptome- wide investigation of circular RNAs in rice.2015 Oct 14
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文献和实验相关实验
。 简而言之，RNA-Seq 使我们能够以前所未有的灵敏度评估整个转录组，并在特定于所研究主题的条件和时间点下生成转录组的快照。尽管这是对更广泛的 RNA-Seq 领域的非常合适和简短的总结，但仍有许多类型的 RNA-Seq 可供尝试。 短读长测序是 RNA-seq 的常用方式。测序通常从样本材料中生成的较短的插入片段，长度在 50 – 500 bp 之间，然后在下游数据分析中重新组装或计数。长读长测序经常在 DNA-Seq 和 RNA-Seq 中以高容量确定手头样本的序列，例如，一次 10,000 –
RNA测序 (RNA Sequencing，简称RNA-Seq) ，是基于高通量测序技术的转录组学研究方法，可以快速对基因组中的RNA种类和数量进行分析，揭示特定生物学或疾病发生过程中的分子机制。
1、PCR 产物测序时出现重叠峰 问题图1（模板中有碱基缺失，往往是单一位点（1-1）或两个位点（1-2）碱基缺失导致测序结果移码） 图1-1 图1-2 解决方法：将PCR 产物克隆到质粒（如T 载体）中挑单克隆测序，或将PCR 产物进行PAGE纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序。问题图2（PCR 产物不纯，含部分序列一致的两种以上的片段，长度不一） 图2 解决方法：主要原因是PCR 产物没有纯化，含有部分序列一致的两种以上长度不一的片段
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