TOP10化学感受态细胞

【建议】本月讨论与整理专帖-T-A克隆，另开帖不加分！

本月旧帖整理活动专题: T-A克隆技术 大家可以在以下基础上进行整理或对具体问题进行讨论 (1)如何筛选合适的宿主菌株 ◇ 所选的宿主菌株应对所用质粒的抗生素抗性基因敏感。 ◇ 如进行蓝/白斑筛选，宿主菌β-半乳糖苷酶的α-肽编码区应在染色体或附加体上缺失掉（lacZΔΜ15）。TOP10和DH5α都能用于蓝/白斑筛选。 ◇ 要表达重组蛋白，可使用带有可诱导的T7 RNA聚合酶基因的菌株，如BL21（DE3）。 ◇ 使用pGEM载体克隆大片段时（>7-8 kb），经转化

大肠杆菌感受态细胞制备及外源DNA的转化

法、 CaCl2、 RuCl等化学试剂法感受态细胞：处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源 DNA 分子通过时细胞的状态。转化细胞(转化子)：带有异源 DNA 分子的受体细胞( Transformant )。本实验以 E.coli DH5α 菌株为受体细胞，用 CaCl2 处理受体菌使其处于为感受态，然后与 pUC18质粒共保温，实现转化。 pUC18质粒携带有抗氨苄青霉素的基因，因而使接受了该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉的特性，用 Apr符号表示。将经过转化后的全部受体细胞经过适应稀释，在含氨

酵母质粒抽提方法

4℃，14000r/m离心10min。　　7.12 弃上清，空气中干燥。　　7.13 10μl H2O悬浮细胞。8、转化（要求：4℃预冷）　　8.1 冰上融化感受态细胞（感受态细胞的制备见分子克隆啦）Top10f’。　　8.2 加100μl转化细胞到预冷的1.5ml离心管中，枪头轻轻吹打混匀。　　8.3 冰上孵育30min。　　8.4 42℃，45S～50S。　　8.5 冰上孵育2min后，加1ml LB。　　8.6 37℃，1h，250r/m.　　8.7 2500r/m