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- KALANG/进口品牌
- 中国/美国
- KL788Mu02
- 2025年08月01日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 保质期：
6-12months
- 英文名：
Recombinant Programmed Cell Death Protein 1 Ligand 1 (PDCD1LG1)
- 库存：
大量
- 供应商：
康朗生物
- 规格：
50ug/100ug/1mg
www.shklbio.com
1.基因扩增
（1）引物合成
搜索目标蛋白基因信息，结合蛋白的结构信息，选取片段或全长设计引物。注意避开跨膜区，以及复杂的二级结构，优选N端或C端，引物评分尽可能高，并搜索出核酸序列的酶切位点，使用载体等信息。经研发部根据研发经验提出修改意见最终定稿后交由第三方公司进行引物合成。
（2）基因克隆机重组鉴定
1）PCR
根据目的蛋白特异性表达组织，选取特异组织RNA用上述引物进行PCR扩增。进行琼脂糖凝胶电泳后，根据分子量大小选取目标片段进行切胶回收。再次PCR扩增，获得大量DNA，并进行PCR产物回收。
2）酶切，连接
根据酶切位点，将目标PCR产物以及相应载体进行酶切，获得粘性末端的DNA产物后，进行琼脂糖凝胶电泳，根据目标条带大小选取相应片段切胶回收。并将具有相同酶切位点的载体与DNA片段进行连接
3）转化，挑菌验证
将连接好的目的片段转化感受态E.coli,并在LB平板上进行过夜培养。挑取平板上的菌斑进行验证PCR，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据目标条带大小选取相应菌液进行测序，测序正确后留种保存。
2.蛋白表达
（1）蛋白表达小试
挑取少量菌种进行培养，并诱导表达，将表达的蛋白进行SDS-PAGE，根据目标条带大小判断目标蛋白是否表达，小试表达成功后将进行蛋白预放大实验
（2）蛋白放大实验
将小试表达成功的蛋白菌株用400-800 ml培养基进行培养表达，进行SDS-PAGE，根据目标条带大小判断目标蛋白是否表达成功，预放大实验成功后将进行进一步的蛋白放大实验，放大实验使用800-1600 ml培养基进行培养，具体验证同上。
3.蛋白纯化
由于载体中包含了his标签，故采用镍柱进行纯化。有些蛋白可能会形成包涵体，在之前的一篇专题中我们有详细介绍过大肠杆菌重组蛋白纯化方法,纯化后的蛋白会进行SDS-PAGE， BCA等实验分子量以及纯度进行验证，纯度超过95%。
4. 质量检测
获得蛋白后会进行冻干，冻干之后会进行常规蛋白实验进行验证，合格后保存。
重组蛋白的制备主要是依据以上原理及步骤。以上是以原核表达举例。在制备过程中每一个环节都至关重要，不同的蛋白会在不同的环节出现技术难点，包括目的基因的扩增，包涵体的形成都会对重组蛋白的研发造成困境。但Cloud Clone Corp. 具有多年研发经验，还可提供真核表达系统，哺乳动物细胞表达系统，用户可根据需要选择，同时对蛋白有特殊要求我们也可提供私人定制。
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文献和实验成分。5.优化表达条件（1）重组蛋白不表达或者表达量低。如果重组蛋白不表达（包含体和可溶蛋白都没有）通过改变诱导剂浓度，诱导温度，时间等都不表达的时候，然后尝试更换菌株、质粒载体。降低诱导后培养温度。重组蛋白表达得越慢，其折叠效果就越好，大肠杆菌在4℃时依然可以表达重组蛋白，而将培养温度降低至25-30℃就能显著改善蛋白折叠。此方法不适用于温度诱导的重组蛋白表达；减少诱导剂。诱导剂浓度可以降低至1/10；选用Lac渗透酶缺陷型菌株，如Tuner、Rosetta等，也有很好的效果。这类菌株能够使进入每个细胞
纯化最常用的方法之一，是亲和层析法，借助标签和配体的亲和力进行蛋白纯化。纯化的重组蛋白通常能以特异性的方式被洗脱，例如，在 Strep 标签蛋白纯化中，加入生物素(biotin)即可断开 Strep 标签与配体 Strep - Tactin 的作用，达到有效洗脱的目的。得到高纯度有活性的蛋白质应用在多种下游实验中，如研究蛋白质间相互作用等。 那么是否可以以此为基础，将标签配体亲和力加以利用，结合免疫识别特性，用温和的方法得到高纯度的目的细胞呢？ 一、「画龙点睛」的表位标签—— Fab
，PD-1/PD-L1这么值钱，大家一定好奇它到底是什么鬼。 PD-1全名是程序性死亡分子1(programmed death-1)是Ishida等[1]通过消减杂交技术于1992年发现的[2]，是CD28家族成员，胞质区含有2个酪氨酸残基，1个位于靠近N端的免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)中，另一个1个位于靠近C端的免疫受体酪氨酸转化基序(ITSM)中[2]。 PD-L1(CD274)是B7家族成员，是PD-1的配体，属于1型跨膜蛋白，全长290个氨基酸，包含1个IgV样
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