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文献和实验AAV 三保一是什么？shRNA 体内敲低一次保一条有效靶点
靶点对比 设计要点 做法 为什么 多靶点并行 单基因设计 3 条独立 shRNA 覆盖单靶点的随机失效 区域分散 分别靶向 CDS / 3'UTR 等不同区段 避免 mRNA 折叠致全部失效 GC 适中 推荐 35%–55% 范围 平衡稳定性与特异性、优化加工 脱靶低 避开基因组同源区域 保证干扰特异性 载体适配 U6 Pol Ⅲ 驱动，经典 GV478 载体（U6-MCS-CAG-EGFP） 高效转录、被 Dicer 加工 判定标准 RT-qPCR ΔCt
AAV 装载容量 4.7kb 超限怎么办？元件长度和五种扩容方案一篇讲清
长度表，是审载体时直接对照用的（长度为常见近似，具体以序列实测为准）： 元件 约占用长度 说明 ITR（2 个） 约 0.3 kb（两侧各约 0.15 kb） 包装必需，不能删，是硬成本 启动子 CAG 约 1.7 kb；CMV 较小；hSyn/CaMKIIα/GFAP 等特异启动子长短不一 想省空间可换短启动子 目的基因（cDNA） 视基因而定，是主要变量 大基因最容易超限 标签（EGFP/Flag/mCherry 等） EGFP 约 0.7 kb；其他标签数百 bp
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