Hieff™ I Reverse Transcriptase

Hieff™ I Reverse Transcriptase 第一代耐热逆转录酶产品描述

HieffTM I Reverse Transcriptase是在M-MLV (RNase H-) Reverse Transcriptase基础上经过多点突变得到的全新逆转录酶。HieffTM Reverse Transcriptase热稳定性提高，在50℃下活性最高，且可耐受高达55℃的反应温度，适用于具有二级结构的RNA模板的逆转录，能稳定可靠地合成cDNA。该酶与模板的亲和力增强，可获得更多全长的cDNA，并可检测到低至1 pg的总RNA，特别适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录。此外，HieffTM I Reverse Transcriptase降低了逆转录过程的错配率，提高了克隆的保真度。

Hieff™ I Reverse Transcriptase 第一代耐热逆转录酶产品组分

编号

组分

产品编号/规格

11101ES84 (2,000U)

11101ES92 (10,000U)

11101-A

5×HieffTM I Reaction Buffer

100 μl

100 μl×5

11101-B

HieffTM I Reverse Transcriptase (200 U/μl)

10 μl

50 μl

活性定义

以Poly(rA) Oligo(dT)为模板/引物，在37℃，10分钟内，掺入1 nmol的dTTP为酸不性溶物质所需要酶量定义为1个活性单位（U）。

运输与保存方法

冰袋（wet ice）运输。收到产品后放到-20 ºC保存。

质量控制

核酸外切酶残留检测：200 U本品和0.6 μg λ-Hind Ⅲ在37 ºC下孵育1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。

核酸内切酶残留检测：200 U本品和0.6 μg Supercoiled pBR322 DNA在37 ºC下孵育1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。

RNase残留检测：200 U本品和1 μg小鼠肝脏总RNA在37 ºC下孵育1小时，RNA电泳谱带不发生变化。

功能检测1：逆转录体系中加入200 U本品，以500 ng Hela cell total RNA为模板，Oligo(dT)18为引物，50 ºC反应45分钟。取10% cDNA产物进行PCR扩增DNCH基因。琼脂糖凝胶电泳，EB染色，可见有单一的5.6 kb条带。

功能检测2：逆转录体系中加入200 U本品，以100 pg Hela cell total RNA为模板，Oligo(dT)18为引物，50 ºC反应30分钟。取10% cDNA产物进行PCR扩增β-actin基因。琼脂糖凝胶电泳，EB染色，可见有单一的550 bp条带。

Hieff™ I Reverse Transcriptase 第一代耐热逆转录酶注意事项

1）请保持实验区域洁净；操作时需穿戴干净的手套、口罩；实验所用的离心管、枪头等耗材均需保证RNase free，以防止RNase污染。

2）为保证逆转录成功，建议使用高质量的RNA样本。

3）为了您的健康，实验操作时请穿实验服和带一次性手套。

应用实例

1. RNA模板变性

【注意】RNA模板变性有助于打开二级结构，可在很大程度上提高第一链cDNA的产量。对于长度超过3 kb的cDNA片段，请务必进行此步操作。对于GC含量很高（50%以上）建议也进行此步操作。

RNase free离心管中配制如下混合液【表1】，65℃ 加热5 min，迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2 min。

表1 模板RNA变性混合体系

RNase free ddH2O

to 13 μl

Oligo(dT)18(0.5 μg/μl)

or Random hexamers(0.1μg/μl)

or Gene Speicific Primers(2 μM)

1 μl

模板RNA

Total RNA:50 ng-5μg;

Poly(A)+ RNA: 5-500 ng

2. 第一链cDNA合成体系

在RNase free离心管中配制如下混合液【表2】：

表2 第一链cDNA合成反应体系

上一步的模板RNA变性混合体系

13 μl

5×HieffTM I Reaction Buffer

4 μl

dNTP Mixture(10 mM each)

1 μl

RNase inhibitor (40 U/μl)

1 μl

HieffTM I Reverse Transcriptase(200 U/μl)

1 μl

3. 按照下列条件进行第一链合成反应：

使用Oligo(dT)18

50℃*

50 min

65℃**

15 min

[*]：当模板GC含量高（50%以上）或者二级结构复杂，可将逆转录温度提高到55℃。对于Oligo(dT)18引物，要在55℃逆转录。需要先在42℃孵育5min，然后在55℃孵育50min。

[**]：65℃加热15min的目的是失活逆转录酶。

使用Random hexamers

25℃

10 min

50℃*

50 min

65℃**

15 min

[*]：当模板GC含量高（50%以上）或者二级结构复杂，可将逆转录温度提高到55℃。

[**]：65℃加热15min的目的是失活逆转录酶。

使用Gene Speicific Primers

50℃*

50 min

65℃**

15 min

[*]：当模板GC含量高（50%以上）或者二级结构复杂，可将逆转录温度提高到55℃。

[**]：65℃加热15min的目的是失活逆转录酶。

得到的第一链cDNA反应产物可立即用于PCR反应，或在-20℃保存，并在半年内使用；长期存放建议分装后在-80℃保存。cDNA应避免反复冻融。用于PCR反应的cDNA产物体积建议取PCR反应体积的1/10-1/5。

Hieff™ I Reverse Transcriptase 第一代耐热逆转录酶yb1855 hBMP7-ELISA 人BMP-7ELISA试剂盒 Human BMP-7 ELISA Kit 96 tests
yb1856 hp53-ELISA 人p53 ELISA试剂盒 Human p53 ELISA Kit 96 tests
yb1857 hCEA-ELISA 人CEAELISA试剂盒 Human CEA ELISA Kit 96 tests
yb1858 hTLR2-ELISA 人TLR2ELISA试剂盒 Human TLR2 ELISA Kit 96 tests
yb1859 hTLR3-ELISA 人TLR3ELISA试剂盒 Human TLR3 ELISA Kit 96 tests
yb1860 hTF/F3-ELISA 人组织因子/F3ELISA试剂盒 Human Tissue factor/F3 ELISA Kit 96 tests
yb1861
yb1862
yb1863 mBDNF-ELISA 小鼠脑源性神经生长因子ELISA试剂盒 Mouse BDNF ELISA Kit 96 tests
yb1864 mBMP-2-ELISA 小鼠BMP-2ELISA试剂盒 Mouse BMP-2 ELISA Kit 96 tests
yb1865 mEGF-ELISA 小鼠表皮生长因子ELISA试剂盒 Mouse EGF ELISA Kit 96 tests
yb1866 mEPO-ELISA 小鼠促红细胞生成素ELISA试剂盒 Mouse EPO ELISA Kit 96 tests
yb1867 mFAS-ELISA 小鼠凋亡相关因子ELISA试剂盒 Mouse FAS ELISA Kit 96 tests
yb1868 mFN-ELISA 小鼠胚胎纤维连接蛋白ELISA试剂盒 Mouse Fibronectin ELISA Kit 96 tests
yb1869 mG-CSF-ELISA 小鼠粒细胞集落刺激因子ELISA试剂盒 Mouse G-CSF ELISA Kit 96 tests
yb1870 mGM-CSF-ELISA 小鼠粒细胞巨噬细胞刺激因子ELISA试剂盒 Mouse GM-CSF ELISA Kit 96 tests
yb1871 mICAM-1-ELISA 小鼠细胞间粘附分子ELISA试剂盒 Mouse ICAM-1 ELISA Kit 96 tests
yb1872 mIFN-γ-ELISA 小鼠IFN-γELISA试剂盒 Mouse IFN-γ ELISA Kit 96 tests
yb1873 mIGF-1-ELISA 小鼠IGF-1ELISA试剂盒 Mouse IGF-1 ELISA Kit 96 tests
yb1874 mIGF-2-ELISA 小鼠IGF-2 ELISA试剂盒 Mouse IGF-2 ELISA Kit 96 tests
yb1875 mIGFBP-1-ELISA 小鼠IGFBP-1ELISA试剂盒 Mouse IGFBP-1 ELISA Kit 96 tests
yb1876 mIGFBP-3-ELISA 小鼠IGFBP-3ELISA试剂盒 Mouse IGFBP-3 ELISA Kit 96 tests