Hieff™ II Reverse Transcriptas

Hieff™ II Reverse Transcriptase 第二代耐热逆转录酶产品描述

HieffTM II Reverse Transcriptase（第二代耐热逆转录酶）是HieffTM I Reverse Transcriptase（第一代耐热逆转录）的升级产品，是在M-MLV (RNase H-) Reverse Transcriptase基础上通过体外分子进化技术获得的全新耐热逆转录酶。与上一代相比，HieffTM II进一步大幅提高了热稳定性，50℃下半衰期超过240min，并长时间耐受55℃高温且保持稳定，非常适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。此外，HieffTM II增加了多个突变位点，进一步增强了模板亲和力和行进性，大幅提升全长cDNA的合成能力，可获得长达20 kb的cDNA。另外，HieffTM II对于常见的逆转录抑制物具有更高的耐受度，非常适合于植物组织RNA的逆转录反应。

Hieff™ II Reverse Transcriptase 第二代耐热逆转录酶产品组分

编号

组分

产品编号/规格

11106ES84 (2,000U)

11106ES92 (10,000U)

11106-A

5×HieffTM II Reaction Buffer

100 μl

100 μl×5

11106-B

HieffTM II Reverse Transcriptase (200 U/μl)

10 μl

50 μl

活性定义

以Poly(rA) Oligo(dT)为模板/引物，在37℃，10min内，掺入1 nmol的dTTP为酸不性溶物质所需要酶量定义为1个活性单位（U）。

运输与保存方法

冰袋（wet ice）运输。收到产品后放到-20 ºC保存。

质量控制

核酸外切酶残留检测：200 U本品和0.6 μg λ-Hind Ⅲ在37 ºC下孵育1h，DNA的电泳谱带不发生变化。

核酸内切酶残留检测：200 U本品和0.6 μg Supercoiled pBR322 DNA在37 ºC下孵育1h，DNA的电泳谱带不发生变化。

RNase残留检测：200 U本品和1 μg小鼠肝脏总RNA在37 ºC下孵育1h，RNA电泳谱带不发生变化。

功能检测1：逆转录体系中加入200 U本品，以100 pg Hela cell total RNA为模板，Oligo(dT)23为引物，50 ºC反应30min。取10% cDNA产物进行PCR扩增β-actin基因。琼脂糖凝胶电泳，EB染色，可见有单一的550 bp条带。

功能检测2：逆转录体系中加入200 U本品，以500 ng Hela cell total RNA为模板，Oligo(dT)23为引物，55 ºC反应45min。取10% cDNA产物进行PCR扩增Polε基因。琼脂糖凝胶电泳，EB染色，可见有单一的4.8 kb (GC-rich)条带。

功能检测3：逆转录体系中加入200 U本品，以1 pg-1 μg Hela cell total RNA为模板，Oligo(dT)23VN和Random Hexamers为引物，测试qRT-PCR 性能。以6个数量级的模板量的对数值对Ct值做标准曲线，R2>0.990，斜率在-3.20到-3.60之间。

准备工作

1. 防止RNase污染：

请保持实验区域洁净；操作时需穿戴干净的手套、口罩；实验所用的离心管、枪头等耗材均需保证RNase free。

2. 引物选择：

2.1 后续实验为PCR

a, 如果模板为真核生物来源，一般情况下首选Oligo dT18，与真核生物mRNA的3’Poly A尾配对，可获得最高产量的全长cDNA。

b, 基因特异性引物 (GSP)的特异性最高。但有些情况下，用于PCR反应的GSP无法有效引导第一链cDNA合成。这时，可改用Oligo dT18或Random hexamers重新进行逆转录。

c, Random hexamers特异性最低，所有RNA，包括mRNA, rRNA, tRNA均可以作为Random hexamers的模板。当目标区域具有复杂二级结构或GC含量较高，或者模板为原核生物来源，使用Oligo dT18或基因特异性引物 (GSP)无法有效引导cDNA合成时，可使用Random hexamers为引物。

2.2 后续实验为qPCR

a, 将Oligo dT18与Random hexamers混合使用，可使mRNA的各个区域均能以相同效率引发cDNA合成，有助于提高定量结果的重复性。

Hieff™ II Reverse Transcriptase 第二代耐热逆转录酶应用实例

1. 后续实验为PCR

1.1 RNA模板变性

【注意】：RNA模板变性有助于打开二级结构，可在很大程度上提高第一链cDNA的产量。对于长度超过3 kb的cDNA片段，请务必进行此步操作。

在RNase free离心管中配制如下混合液【表1】，65℃ 加热5 min，迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2 min。

表1 模板RNA变性混合体系

RNase free ddH2O

to 13 μl

Oligo(dT)18(50 μM)

or Random hexamers(50 ng/μl)

or Gene Speicific Primers(1 μM)

1 μl

模板RNA

Total RNA:100 pg-5μg;

Poly(A)+ RNA:10 pg-500 ng

1.2第一链cDNA合成体系

在RNase free离心管中配制如下混合液【表2】：

表2 第一链cDNA合成反应体系

上一步的模板RNA变性混合体系

13 μl

5×HieffTM II Reaction Buffer

4 μl

dNTP Mixture(10 mM each)

1 μl

RNase inhibitor (40 U/μl)

1 μl

HieffTM II Reverse Transcriptase(200 U/μl)

1 μl

1.3 第一链cDNA合成反应条件【表3】

表3 cDNA合成反应条件

25℃*

5 min

50℃**

45 min

85℃***

5 min

[*]: 仅当使用Random hexamers时需要此步骤；使用Oligo dT18或Gene Specific Primer时省略此步骤。

[**]: 如果模板具有复杂二级结构，可将反应温度提高至55℃，有助于提高产量。

[***]:85℃ 5 min为逆转录酶灭活步骤。

得到的第一链cDNA反应产物可立即用于PCR反应，或在-20℃保存，并在半年内使用；长期存放建议分装后在-80℃保存。cDNA应避免反复冻融。

2. 后续实验为qPCR

2.1 第一链cDNA合成体系

在RNase free离心管中配制如下混合液【表4】：

表4 第一链cDNA合成反应体系（For qPCR）

RNase free ddH2O

to 20 μl

5×HieffTM II Reaction Buffer

4 μl

dNTP Mixture(10 mM each)

1 μl

RNase inhibitor (40 U/μl)

1 μl

HieffTM II Reverse Transcriptase(200 U/μl)

1 μl

Oligo(dT)18(50 μM)

1 μl

Random hexamers* (50 ng/μl)

1 μl

模板RNA

Total RNA:10 pg-1μg;

Poly(A)+ RNA:10 pg-100 ng

2.2第一链cDNA合成反应条件【表5】

表5 cDNA合成反应条件

25℃

5 min

42℃

15 min

85℃

5 min

得到的第一链cDNA反应产物可立即用于qPCR反应，或在-20℃保存，并在半年内使用；长期存放建议分装后在-80℃保存。cDNA应避免反复冻融。

注意事项

为了您的健康，实验操作时请穿实验服和带一次性手套。

Hieff™ II Reverse Transcriptase 第二代耐热逆转录酶yb1828 hCD40L-ELISA 人可溶性CD40LELISA试剂盒 Human soluble CD40L ELISA Kit 96 tests
yb1829 hEGVEGF-ELISA 人内分泌腺来源的血管内皮生长因子ELISA试剂盒 Human EG-VEGF ELISA Kit 96 tests
yb1830 hRes-ELISA 人抵抗素ELISAELISA试剂盒 Human Resistin ELISA Kit 96 tests
yb1831 hTNF 人TNFβELISA试剂盒 Human TNFβ ELISA Kit 96 tests
yb1832 hVEGFC-ELISA 人VEGF-CELISA试剂盒 Human VEGF-C ELISA Kit 96 tests
yb1833 hSurv-ELISA 人生存素ELISA试剂盒 Human Survivin ELISA Kit 96 tests
yb1834 hTSP2-ELISA 人TSP2ELISA试剂盒 Human TSP2 ELISA Kit 96 tests
yb1835 hCD105-ELISA 人CD105ELISA试剂盒 Human CD105 ELISA Kit 96 tests
yb1836 hAPP-ELISA 人APP ELISA试剂盒 Human APP ELISA Kit 96 tests
yb1837 hBAFF-ELISA 人 BAFF ELISA试剂盒 Human BAFF ELISA Kit 96 tests
yb1838 hPCad-ELISA 人P-CadherinELISA试剂盒 Human P-Cadherin ELISA Kit 96 tests
yb1839 hCD40-ELISA 人CD40ELISA试剂盒 Human CD40 ELISA Kit 96 tests
yb1840 hNCAM-ELISA 人CD56/NCAM-1ELISA试剂盒 Human CD56/NCAM-1 ELISA Kit 96 tests
yb1841 hcMet-ELISA 人c-Met/HGFRELISA试剂盒 Human c-Met/HGFR ELISA Kit 96 tests
yb1842 hErbB2-ELISA 人ErbB-2/Neu2ELISA试剂盒 Human ErbB-2/Neu2 ELISA Kit 96 tests
yb1843 hFeuA-ELISA "人胎球蛋白AELISA试剂盒
" HumanFetuin-A ELISA Kit 96 tests
yb1844 hHBEGF-ELISA 人肝素结合表皮生长因子ELISA试剂盒 Human HBEGF ELISA Kit 96 tests
yb1845 hIL6Ra-ELISA 人IL-6RaELISA试剂盒 Human IL-6Ra ELISA Kit 96 tests
yb1846 hIL7-ELISA 人IL-7ELISA试剂盒 Human IL-7 ELISA Kit 96 tests
yb1847 hIL27-ELISA 人IL-27ELISA试剂盒 Human IL-27 ELISA Kit 96 tests
yb1848 hCSF1R-ELISA 人CSF1R/M-CSFRELISA试剂盒 Human CSF1R/M-CSFR ELISA Kit 96 tests
yb1849 hKal3-ELISA 人Kallikrein 3ELISA试剂盒 Human Kallikrein 3 ELISA Kit 96 tests
yb1850 hRANK-ELISA 人 Receptor Activator of NF-κB (RANK)ELISA试剂盒 Human Receptor Activator of NF-κB (RANK) ELISA Kit 96 tests
yb1851 hMPO-ELISA 人过氧化物酶ELISA试剂盒 Human Myeloperoxidase (MPO) ELISA Kit 96 tests
yb1852 hPAI1-ELISA 人PAI-1ELISA试剂盒 Human PAI-1 ELISA Kit 96 tests
yb1853 hDKK1-ELISA 人DKK-1ELISA试剂盒 Human DKK-1 ELISA Kit 96 tests