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上海信裕
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Stemfactor™ Recombinant Mouse Wnt-5a
对于贴壁生长的Stemfactor™ Recombinant Mouse Wnt-5a，相对来说比较简单但很麻烦。以下我主要讨论贴壁生长的Stemfactor™ Recombinant Mouse Wnt-5a。
在讨论之前，大家首先要有一个概念，即洁净区，并不是没有细菌，而是细菌的数量非常少，国家标准100级的洁净标准是浮游菌数不得超过5个每立方米，沉降菌数不得超过1个每培养皿.而国外的标准比我国的还要高一点，要求的数量更少。
所以在我们的洁净操作台里，并不是真正一个细菌都没有的，所以在操作的时候还是要尽量利索迅速地完成操作。尽量减少进入培养体系细菌的数量。
处理方法如下：
1）.将污染的Stemfactor™ Recombinant Mouse Wnt-5a培养液倒掉，转烧瓶口，加入10mlPBS，适当晃动清洗培养瓶，然后倒掉。转烧瓶口。
2）.继续加入10mlPBS，同样方法晃动，清洗培养瓶，然后倒掉。
3）.继续加入5mlPBS，同样方法洗瓶，主要是培养面，然后倒掉。
4）.重复步骤3再洗。
5）.重复步骤3再洗。
6）.加入3-5ml双抗，洗瓶，静置3-5分钟，然后吸出。
7）.加入3ml双抗，洗瓶，静置3-5分钟，然后吸出。
8）.再加入5mlPBS洗瓶，然后吸出。
9）.加入10ml培养液，加入2ml双抗，将换好新的培养液Stemfactor™ Recombinant Mouse Wnt-5a放置培养箱培养，5小时之后，倒掉培养基，加入PBS洗瓶两次，然后加入胰酶消化，吹打后置于离心机800-1000r/min离心，然后洗一次。置于新的培养瓶里培养，培养体系加入2ml双抗。
10）.24h之后，视情况换液，若仍然污染严重，培养基浑浊，重复以上步骤，若看不到污染物，则继续步骤1)、3）、4）、6）、8），然后加入培养液培养Stemfactor™ Recombinant Mouse Wnt-5a，培养体系加入2ml双抗.
11).24h之后，若仍污染严重，可再重复一次，若还污染只能弃之（不过一般没有出现这种情况），若镜下不见污染物，则换液PBS洗瓶，正常培养。
以上是对于细菌污染（常见为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌）；若为霉菌或者真菌污染，加入两性霉素B清洗和培养，终浓度一般为2.5μg/ml（在30μg/ml时会有细胞毒性）。另外也可以选择在Stemfactor™ Recombinant Mouse Wnt-5a培养基里加3ug/ml的制霉菌素或放线菌素D。其它操作同；预防为主！！所以处理细菌污染的重要原则就是：无限地稀释细菌的浓度，无限地减少细菌的数量！尤其注意血清的质量！这个是主要来源。一般建议用北美血清。
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以上方法主要是针对贴壁生长的Stemfactor™ Recombinant Mouse Wnt-5a，在操作的过程中，一定要小心操作动作，轻柔缓慢，切忌大动作鲁莽。防止Stemfactor™ Recombinant Mouse Wnt-5a脱落。
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文献和实验1. Mouse L-cells (ATCC CCL-1.3 or CRL-2648). 2. Cell culture medium: Same as Section 2.1.2. 3. 96-well tissue culture plate (flat well). 4. Wnt3A samples (CM, fractions from Sections. 2.3 and 2.4 ). 5. PBS. 6. Lysis Buffer: 50 mM Tris-HCl, pH
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