活性氧检测试剂盒/Reactive Oxygen Spec

活性氧检测试剂盒/Reactive Oxygen Species Assay Kit/ROS Assay Kit检测原理

活性氧检测试剂盒（Reactive Oxygen Species Assay Kit）是一种基于荧光染料DCFH-DA（2,7-Dichlorodi -hydrofluorescein diacetate）的荧光强度变化，定量检测细胞内活性氧水平的最常用方法。

DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜。进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不会通透细胞膜，因此探针很容易被积聚在细胞内。细胞内的活性氧能够氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。绿色荧光强度与活性氧的水平成正比。在最大激发波长480nm，最大发射波长525nm处，使用荧光显微镜，流式细胞仪或激光共聚焦显微镜等检测荧光信号，并根据阳性对照Rosup的荧光信号来分析活性氧的真正水平。

活性氧检测试剂盒/Reactive Oxygen Species Assay Kit/ROS Assay Kit产品组分

编号

组分

规格

保存方法

50101-A

DCFH-DA（10mM）

0.1 mL

-20℃，避光保存

50101-B

活性氧阳性对照（Rosup, 50mg/mL）

1.0 mL

-20℃，避光保存

运输与保存

冰袋运输。-20℃干燥避光保存，有效期一年。

检测步骤

1）装载探针

对于刺激时间较短(通常2小时以内)的细胞，先装载探针，后用活性氧阳性对照及感兴趣药物刺激细胞。对于细胞刺激时间较长(通常为6小时以上)的细胞，先用活性氧阳性对照及感兴趣药物刺激细胞，后装载探针。

原位装载探针：仅适用于贴壁细胞。

（1）按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，终浓度为10 umol/L。

（2）去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，对于六孔板通常不少于100ul。

（3） 37℃细胞培养箱内孵育20 min。用无血清培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。

收集细胞后装载探针：适用于贴壁细胞和悬浮细胞。

（1）按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，终浓度为10 umol/L。

（2）收集好的细胞悬浮于稀释好的DCFH-DA，细胞密度为1.0×106~2.0×107。

（3）37℃细胞培养箱内孵育20分钟。每隔3-5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。

（4）用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。直接用活性氧阳性对照

或自己感兴趣的药物刺激细胞，或把细胞等分成若干份后刺激细胞。通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。

2）检测

原位装载探针法：激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。

收集细胞后装载探针：用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，也可以用激光共聚焦显微镜直接观察。

3）参数设置

使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF的荧光光谱和FITC非常相似，可以用FITC的参数设置检测DCF。DCF的激发光谱和发射光谱参考下图。



活性氧检测试剂盒/Reactive Oxygen Species Assay Kit/ROS Assay Kit其他事项说明：

（1）阳性对照推荐按照1∶1000的比例使用。如用1μL的阳性对照刺激1mL装载好探针的细胞。通常刺激后20～30分钟内可以观察到非常显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后30分钟内观察不到活性氧的升高，可以适当提高活性氧阳性对照的浓度。如果活性氧升高得过快，可以适当降低活性氧阳性对照的浓度。

（2）对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1∶2000～1∶5000

稀释DCFH-DA，使装载探针时DCFH-DA的浓度为2～5μmol/L。探针装载的时间也可以根据情况在15～60分钟内适当进行调整。

（3）活性氧阳性对照（Rosup）仅仅用于作为阳性对照的样品，并不是在每个样品中都需加入活性氧阳性对照。

注意事项

1) 探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。

2) 探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的装载情况是否良好。DCF的激发光谱和发射光谱见上图。

3) 尽量缩短探针装载后到测定所用的时间（刺激时间除外），以减少各种可能的误差。

4）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
活性氧检测试剂盒/Reactive Oxygen Species Assay Kit/ROS Assay Kityb0001 仓鼠肾成纤维细胞 BHK-21 [C-13]
yb0002 仓鼠肺细胞 CHL
yb0003 仓鼠肺细胞 V79
yb0004 仓鼠卵巢细胞 CHO
yb0005 仓鼠肺细胞 R 1610
yb0006 仓鼠卵巢细胞,二氢叶酸还原酶缺陷 CHO/dhFr-
yb0007 仓鼠卵巢细胞亚株 CHO-K1
yb0008 仓鼠卵巢细胞 Lec1
yb0009 中国仓鼠卵巢细胞 CTLA4 Ig-24
yb0010 长尾绿猴胚胎细胞 4179
yb0011 长尾绿猴肾细胞 4647
yb0012 大鼠胸大动脉平滑肌细胞 A7r5
yb0013 大鼠成肌细胞 L6
yb0014 大鼠肺泡巨噬细胞 NR8383
yb0015 大鼠心肌细胞 H9c2(2-1)
yb0016 大鼠肝癌细胞 CBRH-7919
yb0017 大鼠肝癌细胞 RH-35
yb0018 大鼠肝细胞 BRL
yb0019 大鼠肝细胞 BRL 3A
yb0020 大鼠胰腺外分泌细胞 AR42J
yb0021 大鼠胶质瘤细胞 C6
yb0022 大鼠乳腺癌细胞 SHZ-88
yb0023 大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(未分化) PC-12
yb0024 大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(低分化) PC-12
yb0025 大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(高分化) PC-12
yb0026 大鼠肾细胞 NRK
yb0027 大鼠肾细胞 NRK-52E