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上皮样
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干冰运输
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贴壁生长
Coelenterazine 400a 腔肠素 400a背景描述
腔肠素（Coelenterazine）是自然界中资源最丰富的天然荧光素，是绝大多数海洋发光生物（超过75%）的光能贮存分子。腔肠素可作为许多荧光素酶的底物，比如海肾荧光素酶（Rluc），Gaussia分泌型荧光素酶（Gluc），以及包括水母发光蛋白（aequorin）和薮枝螅发光蛋白（Obelia）在内的光蛋白（Photoproteins）。其发光原理是：以腔肠素为底物的荧光素酶在有分子氧的条件下，氧化腔肠素，产生高能量的中间产物，并在此过程中发射蓝色光，峰值发射波长约为450~480nm。与甲虫（或萤火虫）荧光素/荧光素酶系统不同，腔肠素/荧光素酶系统不需要三磷酸腺苷（ATP），因此更便于体内生物荧光的研究。因此，腔肠素常用作基于荧光分析的报告基因检测以及活体动物检测的发光底物。
腔肠素还能在酶非依赖性的氧化体系中自发荧光，细胞和组织内的超氧阴离子和过氧化亚硝基阴离子能够增强该自发光信号，因此其也可用来检测细胞/组织内活性氧（ROS）水平。
腔肠素具有能量转移的特性— —生物发光共振能量转移（Bioluminescence Resonance Energy Transfer，BRET），利用此特性，当与荧光蛋白如GFP的突变体（增强的黄色荧光蛋白，EYFP）联合使用，在底物腔肠素存在的情况下，荧光素酶（如Rluc）催化底物发生蓝光，能量随之转移到EYFP上，发出绿光（~530nm）。这两个蛋白的相互作用可以通过Rluc融合蛋白和EYFP融合蛋白两者间的相互关系来评估，适用于研究蛋白-蛋白之间的相互关系。另外，由于BRET的信号可通过比较绿光和蓝光的量来进行测定，消减了因细胞数、细胞类型和其他实验变量而引起的数据变量，适用于高通量筛选如药物开发。
更为重要的一个功能，水母发光蛋白复合物（Aequorin）由22kDa的水母蛋白（Apoaequorin protein）、分子氧和底物腔肠素组成。只有当钙离子（Ca2+）与该复合物结合后，腔肠素才能被氧化生成高能量产物Coelenteramide，同时释放出CO2和蓝色荧光（~466 nm）。正是此Ca2+依赖性的反应过程（见图1），使得腔肠素非常适用于监测活细胞内钙离子水平。与常规的荧光钙离子指示剂相比，其主要具有以下几个优点，1）能检测较大范围的钙浓度 – 从0.1 μM至 >100μM；2）样品无自体荧光，背景荧光低于使用荧光钙离子指示剂；虽然信号比使用荧光钙离子指示剂弱，但是通过成像仪器可以得到更高的信噪比，因此具有更高的灵敏度。3）水母发光蛋白复合体能够稳定维持在细胞内，使其能够进行数小时至数天的钙离子监测。
图1. 腔肠素作为水母发光蛋白辅助因子的Ca2+依赖反应流程
目前商业化的腔肠素应用最普遍的是天然腔肠素（Coelenterazine native），另外还有很多腔肠素衍生物如Coelenterazine h、Coelenterazine 400a、Coelenterazine cp、Coelenterazine f、Coelenterazine hcp、Coelenterazine n等被一一合成。理论上这些腔肠素可用于相同的实验，但是由于其发光波长，细胞膜渗透性，光量子效率上的差异，使得其在相同应用上表现出不同的实验效果。因此非常有必要根据具体实验目的选择最合适的腔肠素底物（见附录1，腔肠素及其衍生物的特性）。
产品描述
本品为粉末形式供应的腔肠素400a（Coelenterazine 400a），也称为DeepBlue CTM，天然腔肠素的衍生物之一，是海肾荧光素酶（Rluc）的良好底物，但是不能被Gaussia分泌型荧光素酶（Gluc）氧化。是BRET（生物发光共振能量转移）研究的首选腔肠素类底物，因其最大发射波长在400nm左右，对GFP受体蛋白的信号干扰最小。
产品性质
英文别名（English synonym）
2,8-Dibenzyl-6-phenyl-imidazo[1,2a]pyrazin-3-(7H)-one; DeepBlueCTM; Di-dehydro Coelenterazine;
CAS号（CAS NO.）
70217-82-2
分子式（Formula）
C26H21N3O
分子量（Molecular weight）
391.48 g/mol
外观（Appearance）
黄色至橘色粉末
溶解性（Solubility）
溶于甲醇或者乙醇，不可溶于DMSO
纯度（Purity）（TLC）
>98%
结构（Structure）
运输和保存方法
冰袋运输。粉末-20℃避光干燥保存，最好保存在惰性气体下以避免接触空气。
Coelenterazine 400a 腔肠素 400a使用方法
1. 腔肠素400a工作液的配制
腔肠素400a溶解特性：腔肠素400a不溶于水，接触空气，水或者任何氧化试剂变得不稳定。切忌溶于DMSO，因为未知或者未研究的反应发生，引起底物的快速降解和未知降解物生成。目前毒性最低的溶剂是100%乙醇，可配制0.1-1mg/ml溶液，然后加入缓冲液，尽量调整缓冲液pH值低于7.0，因为碱性pH会快速降解底物，有时即刻沉淀腔肠素C400a。
腔肠素400a保存特性：最好的方法是使用前将冻干粉溶于乙醇溶液，然后稀释到工作缓冲体系。对于体外实验，需要将稀释好的工作液室温放置20-30min，以达到稳定。此时准备好的底物工作液可放置几个小时，仅可能有非常微弱的信号衰减发生（如室温放置3-4h）。不建议腔肠素400a的乙醇储存液放到-20℃或者更低温度保存，因为其高能量的二氧环丁酮结构即使在低温的情况下也会瞬时降解，导致荧光强度明显变弱。若一定要以储存液的形式短时间保存，-70℃避光保存于塑料管内（溶液中不能含有Ca2+），且保护在惰性气体内。
2. BRET（生物发光共振能量转移）（可根据具体实验有变动）
详细步骤可参考文献：Gersting SW, et al. Bioluminescence resonance energy transfer: an emerging tool for the detection of protein-protein interaction in living cells. Methods Mol Biol. 815:253-63 (2012).
本步骤以融合Rluc的蛋白作为能量供体，融合YFP的蛋白作为能量受体，两者同时电转化进入细胞，并通过加载腔肠素400a底物来启动氧化反应，分析两者BRET信号来研究两个蛋白之间的相互作用。
1） 按照正常流程将能表达两个融合蛋白的质粒（按照3:1的比例，YFP：Rluc）共电转染进入细胞。
2） 转染后的24h进行BRET信号的检测。吸去培养液（留30μl），将96孔板放到荧光酶标仪上。
3） 至少在测定前15min准备腔肠素400a工作液。
腔肠素工作液的配制：称取1mg腔肠素400a粉末直接溶解于1ml的乙醇（或者甲醇）中配置1mg/ml的母液。可用商业化的Rluc反应缓冲液直接稀释1mg/ml的母液到300µM溶液（如127µl母液+1ml Rluc反应缓冲液）。然后取1.1ml 300µM溶液加入6.6ml PBS，混匀。
4） 用超纯水清洗完注射泵后，让泵开始自动吸取配制好的400a工作液，按照每96孔70µl 工作液的量顺序加入，使得每孔中底物的终浓度为30µM。进样结束后，孵育2min。之后马上进行双波长的荧光信号读数，分别为Rluc信号（485nm）和BRET信号（535nm）
3. BRET信号值计算
为了能够进行数据评估，转染细胞的Rluc信号（485nm）应当超过非转染对照细胞的（平均值+9×标准误差）的区间。
1） BRET–ratio（BRET信号比）基于以下等式进行计算，
R=（IA/ID）-cf
R代表BRET比值，ID表示受体YFP荧光信号的强度（535nm），IA表示供体Rluc荧光信号的强度（485nm），cf表示校准因子（BRETcontrol/Rluccontrol D），对照样本是指共转染YFP融合蛋白质粒和不含供体第二个研究蛋白的Rluc载体的细胞荧光信号。
2） 阳性对照，使用YFP-Rluc融合蛋白的BRET比值为1.0。
3） 若蛋白之间有阳性反应，必须检测到：8组蛋白样本中至少有一组能够产生超过设定阈值0.1以上的BRET信号比值。
Coelenterazine 400a 腔肠素 400a注意事项
1） 腔肠素400a粉末最好使用惰性气体-氮气或氩气，在密封良好的塑料管中避光保存于-20℃，长期保存于-70℃。管内即使有少量空气进入，也可能造成400a氧化失活，使量化分析的结果难以在不同试验间进行比较。
2） 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
Coelenterazine 400a 腔肠素 400ayb-557 鼠肝星形细胞
yb-558 大鼠正常肝细胞
yb-559 大鼠肝细胞
yb-560 小鼠成纤维细胞
yb-561 小鼠Mo-MuLv感染的3T3细胞
yb-562 小鼠成纤维细胞
yb-563 逆转录病毒包装的NIH3T3细胞
yb-564 小鼠成纤维细胞
yb-565 小鼠脂肪细胞
yb-566 小鼠巨噬细胞
yb-567 小鼠精母细胞
yb-568 中国仓鼠肺细胞
yb-569 中国仓鼠卵巢细胞
yb-570 中国仓鼠仓鼠卵巢细胞亚株
yb-571 转血小板基因仓鼠卵巢细胞
yb-572 转入Tet-off调控，含EGFP基因的CHO细胞
yb-573 绿猴肾细胞
yb-574 非洲绿猴非洲绿猴肾细胞
yb-575 猴肾细胞系
yb-576 SV40转化的非洲绿猴肾细胞
yb-577 狗肾细胞
yb-578 大鼠肝星形细胞
yb-579 大鼠肝星形细胞
yb-580 大鼠肝星形细胞
yb-581 大鼠肝上皮样干细胞
yb-582 鼠肌原细胞
yb-583 大鼠肺上皮Ⅱ型细胞
yb-584 小鼠肺成纤维细胞
yb-585 大鼠胸主动脉平滑肌细胞，ATCC：A10
yb-586 小鼠胚成纤维包装细胞
yb-587 小鼠胚成纤维包装细胞
yb-588 叙利亚仓鼠肾细胞
yb-589 转S9基因仓鼠卵巢细胞
yb-590 转S9基因仓鼠卵巢细胞
yb-591 大鼠巨噬细胞
yb-592 非洲绿猴肾细胞
yb-593 非洲绿猴肾细胞
yb-594 猴肾细胞系
yb-595 小鼠肾小球系膜细胞
yb-596 小鼠肾系膜细胞
yb-597 大鼠肾成纤微细胞
yb-598 小鼠皮肤细胞
yb-599 小鼠皮肤细胞
yb-600 小鼠前成骨细胞
yb-601 小鼠成骨细胞系
yb-602 鼠胚成骨细胞
yb-603 大鼠肾小管上皮细胞，ATCC：CRL-6509
yb-604 大鼠肾细胞
yb-605 小鼠饲养层上皮细胞
腔肠素（Coelenterazine）是自然界中资源最丰富的天然荧光素，是绝大多数海洋发光生物（超过75%）的光能贮存分子。腔肠素可作为许多荧光素酶的底物，比如海肾荧光素酶（Rluc），Gaussia分泌型荧光素酶（Gluc），以及包括水母发光蛋白（aequorin）和薮枝螅发光蛋白（Obelia）在内的光蛋白（Photoproteins）。其发光原理是：以腔肠素为底物的荧光素酶在有分子氧的条件下，氧化腔肠素，产生高能量的中间产物，并在此过程中发射蓝色光，峰值发射波长约为450~480nm。与甲虫（或萤火虫）荧光素/荧光素酶系统不同，腔肠素/荧光素酶系统不需要三磷酸腺苷（ATP），因此更便于体内生物荧光的研究。因此，腔肠素常用作基于荧光分析的报告基因检测以及活体动物检测的发光底物。
腔肠素还能在酶非依赖性的氧化体系中自发荧光，细胞和组织内的超氧阴离子和过氧化亚硝基阴离子能够增强该自发光信号，因此其也可用来检测细胞/组织内活性氧（ROS）水平。
腔肠素具有能量转移的特性— —生物发光共振能量转移（Bioluminescence Resonance Energy Transfer，BRET），利用此特性，当与荧光蛋白如GFP的突变体（增强的黄色荧光蛋白，EYFP）联合使用，在底物腔肠素存在的情况下，荧光素酶（如Rluc）催化底物发生蓝光，能量随之转移到EYFP上，发出绿光（~530nm）。这两个蛋白的相互作用可以通过Rluc融合蛋白和EYFP融合蛋白两者间的相互关系来评估，适用于研究蛋白-蛋白之间的相互关系。另外，由于BRET的信号可通过比较绿光和蓝光的量来进行测定，消减了因细胞数、细胞类型和其他实验变量而引起的数据变量，适用于高通量筛选如药物开发。
更为重要的一个功能，水母发光蛋白复合物（Aequorin）由22kDa的水母蛋白（Apoaequorin protein）、分子氧和底物腔肠素组成。只有当钙离子（Ca2+）与该复合物结合后，腔肠素才能被氧化生成高能量产物Coelenteramide，同时释放出CO2和蓝色荧光（~466 nm）。正是此Ca2+依赖性的反应过程（见图1），使得腔肠素非常适用于监测活细胞内钙离子水平。与常规的荧光钙离子指示剂相比，其主要具有以下几个优点，1）能检测较大范围的钙浓度 – 从0.1 μM至 >100μM；2）样品无自体荧光，背景荧光低于使用荧光钙离子指示剂；虽然信号比使用荧光钙离子指示剂弱，但是通过成像仪器可以得到更高的信噪比，因此具有更高的灵敏度。3）水母发光蛋白复合体能够稳定维持在细胞内，使其能够进行数小时至数天的钙离子监测。
图1. 腔肠素作为水母发光蛋白辅助因子的Ca2+依赖反应流程
目前商业化的腔肠素应用最普遍的是天然腔肠素（Coelenterazine native），另外还有很多腔肠素衍生物如Coelenterazine h、Coelenterazine 400a、Coelenterazine cp、Coelenterazine f、Coelenterazine hcp、Coelenterazine n等被一一合成。理论上这些腔肠素可用于相同的实验，但是由于其发光波长，细胞膜渗透性，光量子效率上的差异，使得其在相同应用上表现出不同的实验效果。因此非常有必要根据具体实验目的选择最合适的腔肠素底物（见附录1，腔肠素及其衍生物的特性）。
产品描述
本品为粉末形式供应的腔肠素400a（Coelenterazine 400a），也称为DeepBlue CTM，天然腔肠素的衍生物之一，是海肾荧光素酶（Rluc）的良好底物，但是不能被Gaussia分泌型荧光素酶（Gluc）氧化。是BRET（生物发光共振能量转移）研究的首选腔肠素类底物，因其最大发射波长在400nm左右，对GFP受体蛋白的信号干扰最小。
产品性质
英文别名（English synonym）
2,8-Dibenzyl-6-phenyl-imidazo[1,2a]pyrazin-3-(7H)-one; DeepBlueCTM; Di-dehydro Coelenterazine;
CAS号（CAS NO.）
70217-82-2
分子式（Formula）
C26H21N3O
分子量（Molecular weight）
391.48 g/mol
外观（Appearance）
黄色至橘色粉末
溶解性（Solubility）
溶于甲醇或者乙醇，不可溶于DMSO
纯度（Purity）（TLC）
>98%
结构（Structure）
运输和保存方法
冰袋运输。粉末-20℃避光干燥保存，最好保存在惰性气体下以避免接触空气。
Coelenterazine 400a 腔肠素 400a使用方法
1. 腔肠素400a工作液的配制
腔肠素400a溶解特性：腔肠素400a不溶于水，接触空气，水或者任何氧化试剂变得不稳定。切忌溶于DMSO，因为未知或者未研究的反应发生，引起底物的快速降解和未知降解物生成。目前毒性最低的溶剂是100%乙醇，可配制0.1-1mg/ml溶液，然后加入缓冲液，尽量调整缓冲液pH值低于7.0，因为碱性pH会快速降解底物，有时即刻沉淀腔肠素C400a。
腔肠素400a保存特性：最好的方法是使用前将冻干粉溶于乙醇溶液，然后稀释到工作缓冲体系。对于体外实验，需要将稀释好的工作液室温放置20-30min，以达到稳定。此时准备好的底物工作液可放置几个小时，仅可能有非常微弱的信号衰减发生（如室温放置3-4h）。不建议腔肠素400a的乙醇储存液放到-20℃或者更低温度保存，因为其高能量的二氧环丁酮结构即使在低温的情况下也会瞬时降解，导致荧光强度明显变弱。若一定要以储存液的形式短时间保存，-70℃避光保存于塑料管内（溶液中不能含有Ca2+），且保护在惰性气体内。
2. BRET（生物发光共振能量转移）（可根据具体实验有变动）
详细步骤可参考文献：Gersting SW, et al. Bioluminescence resonance energy transfer: an emerging tool for the detection of protein-protein interaction in living cells. Methods Mol Biol. 815:253-63 (2012).
本步骤以融合Rluc的蛋白作为能量供体，融合YFP的蛋白作为能量受体，两者同时电转化进入细胞，并通过加载腔肠素400a底物来启动氧化反应，分析两者BRET信号来研究两个蛋白之间的相互作用。
1） 按照正常流程将能表达两个融合蛋白的质粒（按照3:1的比例，YFP：Rluc）共电转染进入细胞。
2） 转染后的24h进行BRET信号的检测。吸去培养液（留30μl），将96孔板放到荧光酶标仪上。
3） 至少在测定前15min准备腔肠素400a工作液。
腔肠素工作液的配制：称取1mg腔肠素400a粉末直接溶解于1ml的乙醇（或者甲醇）中配置1mg/ml的母液。可用商业化的Rluc反应缓冲液直接稀释1mg/ml的母液到300µM溶液（如127µl母液+1ml Rluc反应缓冲液）。然后取1.1ml 300µM溶液加入6.6ml PBS，混匀。
4） 用超纯水清洗完注射泵后，让泵开始自动吸取配制好的400a工作液，按照每96孔70µl 工作液的量顺序加入，使得每孔中底物的终浓度为30µM。进样结束后，孵育2min。之后马上进行双波长的荧光信号读数，分别为Rluc信号（485nm）和BRET信号（535nm）
3. BRET信号值计算
为了能够进行数据评估，转染细胞的Rluc信号（485nm）应当超过非转染对照细胞的（平均值+9×标准误差）的区间。
1） BRET–ratio（BRET信号比）基于以下等式进行计算，
R=（IA/ID）-cf
R代表BRET比值，ID表示受体YFP荧光信号的强度（535nm），IA表示供体Rluc荧光信号的强度（485nm），cf表示校准因子（BRETcontrol/Rluccontrol D），对照样本是指共转染YFP融合蛋白质粒和不含供体第二个研究蛋白的Rluc载体的细胞荧光信号。
2） 阳性对照，使用YFP-Rluc融合蛋白的BRET比值为1.0。
3） 若蛋白之间有阳性反应，必须检测到：8组蛋白样本中至少有一组能够产生超过设定阈值0.1以上的BRET信号比值。
Coelenterazine 400a 腔肠素 400a注意事项
1） 腔肠素400a粉末最好使用惰性气体-氮气或氩气，在密封良好的塑料管中避光保存于-20℃，长期保存于-70℃。管内即使有少量空气进入，也可能造成400a氧化失活，使量化分析的结果难以在不同试验间进行比较。
2） 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
Coelenterazine 400a 腔肠素 400ayb-557 鼠肝星形细胞
yb-558 大鼠正常肝细胞
yb-559 大鼠肝细胞
yb-560 小鼠成纤维细胞
yb-561 小鼠Mo-MuLv感染的3T3细胞
yb-562 小鼠成纤维细胞
yb-563 逆转录病毒包装的NIH3T3细胞
yb-564 小鼠成纤维细胞
yb-565 小鼠脂肪细胞
yb-566 小鼠巨噬细胞
yb-567 小鼠精母细胞
yb-568 中国仓鼠肺细胞
yb-569 中国仓鼠卵巢细胞
yb-570 中国仓鼠仓鼠卵巢细胞亚株
yb-571 转血小板基因仓鼠卵巢细胞
yb-572 转入Tet-off调控，含EGFP基因的CHO细胞
yb-573 绿猴肾细胞
yb-574 非洲绿猴非洲绿猴肾细胞
yb-575 猴肾细胞系
yb-576 SV40转化的非洲绿猴肾细胞
yb-577 狗肾细胞
yb-578 大鼠肝星形细胞
yb-579 大鼠肝星形细胞
yb-580 大鼠肝星形细胞
yb-581 大鼠肝上皮样干细胞
yb-582 鼠肌原细胞
yb-583 大鼠肺上皮Ⅱ型细胞
yb-584 小鼠肺成纤维细胞
yb-585 大鼠胸主动脉平滑肌细胞，ATCC：A10
yb-586 小鼠胚成纤维包装细胞
yb-587 小鼠胚成纤维包装细胞
yb-588 叙利亚仓鼠肾细胞
yb-589 转S9基因仓鼠卵巢细胞
yb-590 转S9基因仓鼠卵巢细胞
yb-591 大鼠巨噬细胞
yb-592 非洲绿猴肾细胞
yb-593 非洲绿猴肾细胞
yb-594 猴肾细胞系
yb-595 小鼠肾小球系膜细胞
yb-596 小鼠肾系膜细胞
yb-597 大鼠肾成纤微细胞
yb-598 小鼠皮肤细胞
yb-599 小鼠皮肤细胞
yb-600 小鼠前成骨细胞
yb-601 小鼠成骨细胞系
yb-602 鼠胚成骨细胞
yb-603 大鼠肾小管上皮细胞，ATCC：CRL-6509
yb-604 大鼠肾细胞
yb-605 小鼠饲养层上皮细胞
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