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- 2025年07月16日
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1. 蛋白样品的制备(Protein sample preparation)
可以选用适当的裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行蛋白抽提。
2. 电泳
采用普通的电泳仪就可以满足SDS-PAGE电泳的要求。为方便起见，也可整个SDS-PAGE电泳过程均采用恒压的方式，通常把电压设置在100V，然后设定时间为90－120分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过冲。通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
3. 转膜(Transfer)
转膜时，具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。如使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，转膜电流可设定为80V/2H or 10V过夜。
在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。转膜效果可以通过预染蛋白质分子量标准观察转膜效果，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝染色液对转膜后的PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。
4. 封闭(Blocking)
转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的悦延生物WB洗膜液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕起，以后所有的步骤均要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。可用巴斯特吸管吸尽洗涤液，加入WB封闭液，在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。如背景较高，可以在4℃ 封闭过夜。在整个Western过程中可使用侧摆摇床，侧向摆动速度比较缓慢，而且也容易让溶液覆盖蛋白膜。
5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)
参考文献，按比例用WB一抗稀释液适当稀释一抗。用巴斯特吸管吸尽封闭液，不要漂洗，直接加入稀释好的一抗，室温侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时在再37℃水箱一小时。如果效果不佳，可以在4℃缓慢摇动孵育过夜。回收一抗，加入WB洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。洗净洗涤液后，再加入WB洗涤液，，漂洗3-6次，每次5-10分钟。如果结果背景较高可以适当延长漂洗时间并增加漂洗次数。
6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)
参考文献，按照适当比例用WB二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。用巴斯特吸管吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。回收二抗，加入WB洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。洗净洗涤液后，再加入洗涤液，漂洗3-5次，每次5-10分钟。如果显色结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
7. 蛋白检测(Detection of proteins)
检测结果可使用相应显色试剂来检测蛋白，具体使用细节请参考相关文献。.
8. 膜的重复利用(Membrane recovery)
如果蛋白样品非常宝贵，可以使用悦延生物WB抗体去除液处理蛋白膜，以重复利用蛋白膜。
9.您需提供
需新鲜或正确保存的蛋白样品或者蛋白粗提液，阳性对照样品（如果有）， 检测目的蛋白的一抗（或由悦延生物代购）。组织样品不少于50mg；细胞不少于5×106个；总蛋白浓度不低于 2μg/μl（至少50μl）。
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文献和实验Western Blot详解－主要试剂 主要试剂 1、 丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。 2、 十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v
一、经乙二醛和二甲基亚砜变性处理后进行的RNA电泳 这一方法原于McMaster和Carmichael(1977)。 含有乙二醛－DMSO的凝胶比含有甲醛的凝胶更难于进行电泳， 因为前者泳动速率较慢而且需将电泳液时行循环以避免电泳过程中形成过高的H＋梯度。尽管上述两种凝胶具有近乎相等的分辨率（Miller，1987），但用含朋乙二醛－DMSO的凝胶对RNA进行分级离，通常Northern杂交所显示的RNA条带更为锐利。1、在灭菌的微理离心管内，混匀下列液体：6mol/L乙二醛 5.4μ
经乙二醛和二甲基亚砜变性处理后进行的RNA电泳 这一方法原于McMaster和Carmichael(1977)。 含有乙二醛－DMSO的凝胶比含有甲醛的凝胶更难于进行电泳， 因为前者泳动速率较慢而且需将电泳液时行循环以避免电泳过程中形成过高的H＋ 梯度。尽管上述两种凝胶具有近乎相等的分辨率（Miller，1987），但用含朋乙二醛－DMSO的凝胶对RNA进行分级离，通常Northern杂交所显示的RNA条带更为锐利。 1） 在灭菌的微理离心管内，混匀下列
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