CpG 甲基转移酶 (M.SssI)

■ 阻止限制性内切酶的切割
■ CpG 甲基化依赖性基因表达的研究
■ 研究特异序列与 DNA 大沟的相互作用
■ 改变 DNA 的物理特性
■ 对 DNA 统一进行 [³ H] 标记
■ 减少限制性内切酶的酶切位点数目，提高限制性内切酶的特异性

CpG 甲基化会阻止限制性内切酶的作用，这些酶的完整列表请见甲基化敏感性 。

CpG甲基转移酶(M.SssI)能识别双链 DNA 上的二核苷酸序列 5′...CG...3′ (1) ，并甲基化其中的胞嘧啶残基(C⁵ )。

重组 E. coli 菌株，含有从 Spiroplasma sp. 菌株 MQ1 中克隆得到的 CpG 甲基转移酶基因(2,3) 。

NEBuffer 2 + SAM

[50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂ , 1 mM DTT (pH 7.9 @25°C)]， 加入 160 μM S-腺苷甲硫氨酸 SAM (随酶提供)。37°C温育。

注意：MgCl₂ 并不是必需的辅因子。Mg²⁺ 存在时，M.SssI 更倾向于分散甲基化，而不是连续甲基化，同时，M.SssI 还具有拓扑异构酶的活性（4）。

无核酸内、外切酶污染。

1单位指在20 μl反应体系中，37°C条件下1小时能保护1 μg DNA 不被BstUI限制性内切酶切割所需要的酶量。

4,000 units/ml和20,000 units/ml(通过 λ DNA检测)。

10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.1 mM EDTA, 1mM DTT, 200 μg/ml BSA和50%甘油。贮存于-20°C。

65 ℃ 20 分钟。

 

CpG甲基转移酶可用于研究较高级的真核生物体内胞嘧啶甲基化的功能，其特异性可模拟这些生物基因组的修饰模式(5) 。与哺乳动物甲基转移酶不同(6，7) ，CpG甲基转移酶对未甲基化和半甲基化的DNA底物的甲基化效率是相同的(2) ，因此是更为有效的DNA修饰工具。

只要限制性内切酶的识别位点含有 CG 序列或此二核苷酸的重叠序列，CpG 甲基转移酶均能有效地阻止其发挥切割活性。需要注意的是，CpG 甲基转移酶使 DNA 甲基化，而 E.coli 中的 Mcr 和 Mrr 的限制作用不受甲基化影响，故应使用 Mcr -、Mrr - 的 E. coli 菌株（NEB 提供）作为转化的宿主菌。

胞嘧啶残基被甲基化后，可影响 DNA 的物理特性，如：降低 Z-DNA 形成的自由能（8），增加 DNA 的螺旋程度（6），改变 DNA 十字形突出的动力学特性（9）。由于在化学测序过程中联氨的反应性降低，5-甲基胞嘧啶的位置易于确定下来（10）。

(1) Nur, I. et al. (1985) J. Bacteriol ., 164, 19–24.
(2) Renbaum, P. et al. (1990) Nucl. Acids Res ., 18, 1145–1152.
(3) Forney, J.A. and Jack, W.E. (1991) The NEB Transcript3 :1, 5.; Benoit, C.C.    and Robinson, D.P., unpublished observations.
(4) Matsuo, K. et al. (1994) Nucl. Acids Res ., 22, 5354–5359.
(5) Doerfler, W. (1983) Ann. Rev. Biochem ., 52, 93–124.
(6) Gruenbaum, Y. et al. (1982) Nature , 295, 620–621.
(7) Bestor, T.H. and Ingram, V.M. (1983) Proc. Natl. Acad.Sci . USA, 80, 5559–5563.  
(8) Zacharias, W. et al. (1988) Biochemistr y, 27, 2970–2978.
(9) Murchie, A.I. and Lilley, D.M. (1989) J. Mol. Biol .,205,593–602.
(10) Ohmori, H. et al. (1978) Nucl. Acids Res ., 5, 14791485.