EcoRI

【求助】XbaI和EcoRI双酶切构建时出现空载

wj1989113 最近在构建一个质粒。 根据我的目的基因序列，筛了两个酶切位点，而且只有这两个酶切位点能用，XbaI和EcoRI, 设计引物时XbaI 加了两个保护碱基，EcoRI 加了三个保护碱基。根据takara公司的说明，选择了共用Buffer1xM,酶切，连接，转化之后挑克隆，抽质粒酶切鉴定，发现都是空载体。网上说XbaI对甲基化敏感，有什么对策？因为我别无他选，只能用这两个酶。 不胜

成功进行双酶切实验之实战手册

酶的活性也是影响克隆成败的关键因素： 1）如果限制性内切酶因为保管不当，导致酶失活或部分失活，那么依据DDDesigner计算出来的酶量就不能保证完全酶切。 2）如果制备的质粒DNA的质量不好（如细菌培养时间过长，质粒制备时裂解不充分或裂解时间过长等），那么对这种质粒DNA进行酶切时，即使酶活性正常，酶量足够，也不能实现完全酶切，因为其中很多质粒DNA已经变性，不能被切开。 下面是一个简单的实验设计，可以用于分析各种可能的问题。 如:拟用NEB的EcoRI

【求助】基因串联的方法有哪些？

用于克隆筛选).因为引物上带了EcoRV位点,又可以进一步做成T载体,再把基因克进去,如此反复... 关键是T载体要制备的好，筛选的时候多挑几个克隆,如果需要定向克隆基因的话可利用载体上的引物筛选之,然后利用基因内部合适的酶切位点来验证... 欢迎交流! qianjing930 我做过三段重复片段的串联,用的是pBV220载体. 第一对引物为EcoRI_KpnI_____BamHI;第一段单体插入pBV220载体中的EcoRI