用于原位 PCR 和杂交的密封孵育小室

原位PCR和原位RT

下，用随机六聚物进行逆转录反应； （2）用热启动法进行PCR扩增。标本加热至75℃时加上反应液，覆以盖玻片，四周用指甲油密封。然后将温度升至95℃，2min。再将热循环仪设定为95℃，45s，55℃，1min和75℃，45s，共26次循环； （3）扩增结束后，在80℃烤15min～30min。 3）原位杂交： （1）杂交前标本95℃加热3min； （2）加上杂交液，湿盒内50℃过夜；杂交液组成：25％硫酸葡聚糖，2×SSC，50％甲酰胺，0.33mg/ml变性的鲑鱼

间接原位PCR（原位杂交PCR）

与直接原位PCR所不同的是，靶基因在扩增时不进行标记基团的掺入，而是标记一段与扩增片段互补的探针，在扩增结束后，应用此探针进行原位杂交。因此，此处主要介绍原位杂交，其余方法同原位PCR。 一、预杂交 1. 试剂与配制 2×SSC 50%去离子甲酰胺：用4×SSC配制（v/v） 预杂交液：2×SSC，5%硫酸葡聚糖，50%甲酰胺，0.2%脱脂奶粉 2. 操作方法 ① 在进行完原位PCR扩增后，用2×SSC预浸经乙醇脱水、空气干燥的玻片，并简洗15min；

直接原位PCR（In situ PCR）

原位PCR是原位杂交细胞定位和PCR的高灵敏度相结合的技术，使得靶基因检测有了极大的改进。此技术是在细胞（爬片、甩片或涂片）或组织（石蜡、冰冻切片）上直接对靶基因片段进行扩增，通过掺入标记基团直接显色或结合原位杂交进行检测的方法。 一、组织切片和细胞样品的制备 试剂与配置 10%福尔马林；二甲苯；PBS 操作方法 1. 用10%福尔马林固定组织8~15hr，石蜡包埋，切片（4μm），将切片置于新鲜的二甲苯中处理5min，放入无水乙醇中浸泡5min，取出，空气