Beyo3D™活性氧检测试剂盒(DCFH-DA)

碧云天的Beyo3D™活性氧检测试剂盒(DCFH-DA) (Beyo3D™ Reactive Oxygen Species Assay Kit with DCFH-DA，也称Beyo3D™ ROS Assay Kit with DCFH-DA)，是一种利用荧光探针DCFH-DA进行3D培养的细胞球或类器官中活性氧检测的试剂盒。本试剂盒可快速、便捷地用于3D培养的细胞球或类器官中活性氧检测。通常仅需染色20分钟，就可在荧光显微镜下观察到非常明亮的细胞球或类器官中活性氧绿色荧光染色。本试剂盒适用于荧光显微镜、荧光酶标仪及其它荧光检测系统。

DCFH-DA (即H2DCFDA)本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平[1-2]。碧云天同时提供升级版本的Beyo3D™活性氧检测试剂盒(CM-H2DCFDA) (S1108)，检测效果更好。

本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂Rosup，以便于活性氧的检测。Rosup是一种混合物(Compound mixture)，浓度为50mg/ml。本试剂盒同时提供了Beyo3D™ DCFH-DA Assay Buffer，使用更便捷，通常可以确保获得更稳定可靠的检测效果。使用本试剂盒检测细胞内活性氧的效果请参考图1。

图1.碧云天Beyo3D™活性氧检测试剂盒(DCFH-DA) (S1105)对于3D培养的HCT-116细胞的染色效果图。5000个HCT-116细胞在使用碧云天3D细胞培养包被试剂盒(U形底96孔板) (C0366)包被的U形底96孔板中培养72小时，100μg/ml Rosup诱导细胞球2.5小时，然后吸除培养液后直接加入1X的Beyo3D™ DCFH-DA检测工作液，染色20分钟。结果显示，Beyo3D™活性氧检测试剂盒(DCFH-DA)对于Rosup诱导后的3D细胞染色效果清晰、明亮，Beyo3D™ DCFH-DA染色的对照组细胞无明显阳性染色(B、F)，Hoechst 33342染色的细胞核总体基本一致(C、G)。Beyo3D™ Hoechst 33342染色液(C1345)需自备。实际检测效果会因细胞株、实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。

本试剂盒适用范围广。本试剂盒可用于常规方法培养的3D细胞球或类器官，包括超低吸附细胞培养板、Matrix-Gel™基质胶或Matrigel包被的平板、琼脂糖包被的平板、细胞悬滴培养板等。

本试剂盒使用便捷，整个检测过程仅需约30分钟即可完成。3D细胞球经活性氧阳性对照试剂Rosup等诱导处理后，将本试剂盒中的Beyo3D™ DCFH-DA (1000X)按照相应比例用Beyo3D™ DCFH-DA Assay Buffer配制成Beyo3D™ DCFH-DA检测工作液，避光孵育20分钟，就可进行后续的荧光显微镜拍照等荧光检测和分析。

传统的细胞培养大多以二维(Two-dimensional, 2D)的形式展开，但2D培养的细胞在生长方式、生长形态、分化和功能等方面都与体内生理条件下细胞的真实形态和结构存在明显差异，可能会因为细胞结构和组织形态的缺失，使实验结果的可信度降低[3-5]。三维(Three-dimensional, 3D)细胞培养能够更好地模拟体内细胞生存的微环境，更能代表体内组织，也能更真实的反映细胞与细胞间、细胞与基质间的相互作用，细胞对外源性和内源性刺激的应答也更接近于它们在体内的反应，3D细胞培养从而成为更有价值并更为可信的体外实验模型，能够获得与体内实验更加一致的实验结果[6-7]。

3D肿瘤细胞模型越来越多地被用于了解疾病机制和药物研发。2D培养的肿瘤细胞，其单侧细胞膜可以均匀地获得营养和氧气，而3D培养的肿瘤细胞团的内部细胞获得营养和氧气的机会更少，形成自然的营养和氧气梯度，能更好地模拟体内微环境条件，因此3D培养的肿瘤球状体(Spheroid)或肿瘤类器官(Organoid)等能更好地模拟体内肿瘤，更利于小分子药物筛选或者肿瘤相关分子机制的研究，也更能准确地预测药物治疗的体内反应、疗效或毒性。同时，2D肿瘤细胞模型体外扩增有一定局限性，在传代后容易丧失原肿瘤的遗传异质性，出现优势克隆选择性，从而降低临床相关性。相比于2D细胞模型，3D细胞球或者类器官很多情况下能提供更可信的研究结果，简化并加速药物评价流程。自2009年小肠类器官首次建立至今，3D细胞和类器官研究已经扩展到很多组织系统，并成为生命科学最热门的领域之一。

按照96孔板每孔需要100μl Beyo3D™ DCFH-DA检测工作液，本试剂盒小包装可以进行200个样品的检测，中包装可以进行1000个样品的检测。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
S1105S-1	Beyo3D™ DCFH-DA (1000X)	20µl
S1105S-2	Rosup (50mg/ml)	20µl
S1105S-3	Beyo3D™ DCFH-DA Assay Buffer	20ml
—	说明书	1份

 

产品编号	产品名称	包装
S1105M-1	Beyo3D™ DCFH-DA (1000X)	100µl
S1105M-2	Rosup (50mg/ml)	100µl
S1105M-3	Beyo3D™ DCFH-DA Assay Buffer	100ml
—	说明书	1份

保存条件：

-20ºC保存，一年有效。Beyo3D™ DCFH-DA (1000X)须避光保存。

注意事项：

探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。

探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的装载情况是否良好。

尽量缩短探针装载后到测定所用的时间(刺激时间除外)，以减少各种可能的误差。

荧光酶标仪检测时须使用适合荧光检测的黑板或白板，推荐使用碧云天BeyoGold™超低吸附黑色透明底96孔板(平底带盖, 独立包装) (FULA965)。

细胞球在外力的作用下容易变形或分散，PBS洗涤及换液等过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。

不同种类的细胞球对诱导剂的耐受可能存在一定的差别，3D细胞球经活性氧诱导后，形态可能会发生一些变化，在染色前可以镜下观察细胞球的形态，可以酌情考虑是否选择形态比较完整的细胞球进行染色分析。

荧光物质均易发生淬灭，在进行荧光观察时，尽量缩短观察时间，同时在操作和存放过程中也尽量注意避光保存。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。