18孔血管生成载玻片

品牌	货号	商品名称	包装	描述
COOLRUN	CR215-G-1	血管生成载玻片	独立包装，EO灭菌 一张板有18个孔	可以用于血管生成实验 也可以用于类器官培养

 

血管生成实验说明文档

 一、血管生成概述

 1.1 血管网络的功能  

血管网络在哺乳动物体内发挥着至关重要的运输功能，负责将液体、气体、分子以及细胞等物质输送到全身各个部位。同时，免疫细胞借助血管网络进行巡逻，抵御细菌、病毒和寄生虫的入侵。

 1.2 血管生成的重要性  

- 在正常的生理过程中，血管生成对于胚胎发育、伤口愈合、骨骼生长、妊娠以及月经周期等起着关键作用。

- 疾病关联：当血管生成失调时，可能引发多种疾病，如中风、心肌梗死、动脉粥样硬化和关节炎等。此外，肿瘤血管化是癌症的重要特征之一。

 1.3 血管生成机制  

- 血管形成（Vasculogenesis）：中胚层前体细胞（成血管细胞）分化为内皮细胞，组装形成新血管。  

- 血管新生（Angiogenesis）：通过现有血管的“出芽”扩展血管网络，涉及基底膜穿透、细胞迁移、增殖和通讯。  

- 调控因素：缺氧是主要驱动因素，诱导促血管生成基因（如VEGF）表达。目前，抑制或激活血管生成已成为一些疾病的治疗靶点，例如贝伐单抗被用于转移性结直肠癌和非小细胞肺癌的治疗。

 

 二、血管生成实验方法

 2.1 血管生成实验（Tube Formation Assay）  

 实验原理  

内皮细胞（如HUVECs）在基底膜类似基质（如Matrigel®）上形成毛细血管样结构，模拟体内血管生成过程。  

 实验步骤  

1. 实验准备：

（1）在4°C环境中低温融化基质胶，并预冷相关器材（如枪头、待铺胶细胞培养板等）。铺板操作需在冰盒上进行，以防止基质胶在温暖环境中过早凝固。

（2）使用DMEM或条件培养基将基质胶稀释至8-12 mg/mL，根据实际情况可调整稀释比例。由于不同批次的基质胶浓度存在差异，建议在使用前进行不同梯度的稀释。将稀释后的基质胶分别取10 µl加入孔板内，注意避免产生气泡，然后将孔板置于37℃培养箱中放置30-45 min。

（3）对状态良好的细胞采用标准的传代细胞程序进行处理，并å通过预实验确定合适的细胞铺板数量，使其在24 h内达到约80%的融合度。对HUVEC细胞进行饥饿处理，即将完全培养基更换为含1% FBS的DMEM培养基，培养24 h。

2. 细胞接种：

（1）使用DPBS清洗细胞，随后加入胰蛋白酶对HUVEC进行消化。离心沉淀后，使用含有10% FBS的DMEM或条件培养基重悬细胞，并进行多次细胞计数以取平均值，确保准确性。如果需要获取荧光影像数据，可在DPBS清洗细胞前添加终浓度为2 μg/ml的钙黄绿素AM，将标记后的细胞置于37℃和5%CO₂的黑暗环境中30-45 min，之后进行洗涤以去除多余的钙黄绿素AM。

（2）每孔加入50 μl细胞悬液，推荐HUVECs的接种密度约为10,000±3000细胞/孔。在操作时，需保持枪头垂直于孔的上方，避免枪头接触孔内的凝胶。

3. 成像与分析：

（1）将细胞培养板置于37℃、5% CO₂的环境中静置培养。

（2）可根据需要设置时间梯度进行观察，或在特定时间点进行观察。一般来说，细胞在2-4h内开始形成血管样结构，HUVEC种植至基质胶后约4小时即可初步形成血管样结构，管形成峰值通常出现在2-12h之间，之后结构可能会发生塌缩。

（3）拍摄毛细管网络的图像，并可使用Image J的Angiogenesis Analyzer插件或其他软件对管状网络的节点、管数量、管长度、管面积等表型进行分析。

 常见应用  

- 评估药物促/抗血管生成潜力  

- 研究基因与通路对血管生成的影响  

- 分析抑制剂或增强剂的作用  

 注意事项  

- 细胞密度：HUVECs推荐5,000–10,000细胞/孔，需预实验优化。  

- 基质选择：优先使用生长因子减除型Matrigel®（测试促血管药物时）。  

- 对照设置：阳性对照（无抑制剂）、阴性对照（使用不影响细胞活性的抑制剂）。  

 2.2 血管出芽实验（Sprouting Assay）  

 实验原理  

将多细胞球体置于凝胶基质中，观察内皮细胞向外“发芽”的过程，以模拟血管生成中的出芽现象。  

 实验步骤  

1. 样本制备：将细胞球体嵌入凝胶（如Matrigel®）。  

2. 成像与量化：定期拍摄并测量发芽长度。  

三、实验优化与常见问题  

 4.1 时间框架  

- HUVECs：2–4小时开始血管生成，24小时后细胞凋亡导致管结构破坏。  

- 实时成像：建议每5–15分钟拍摄一次，持续24小时（需自动聚焦和电动载物台）。  

 4.2 实验设计要点  

- 细胞异质性：不同内皮细胞血管生成时间差异大，需预实验确定。  

- 移液精度：使用校准移液器确保凝胶和细胞接种量准确（避免弯液面）。  

Q&A

1. 血管生成实验需要多长时间？

血管生成实验时长受细胞状态和培养基中血管生成因子浓度影响，二者呈正相关。当细胞处于良好状态时，通常在 2 - 3 小时内就能观察到血管生成现象；反之，若细胞状态欠佳，可能要 18 - 24 小时才会出现血管生成。基于此，在初次开展实验时，建议每间隔 4 小时进行一次观察。另外，使用原代细胞进行血管生成实验时，由于细胞特性，血管生成时间可能会有所延迟。

2. 管状网络形成监测方式选择

手动监测和自动监测各有利弊：

l 手动监测：灵活性强，成本较低，但主观性相对较高，重复性较差，且操作过程较为耗时。

l 自动监测：能提供更客观、高效、精确的结果，但成本较高，且适应性有限，软件可能无法满足所有非常规实验设计需求。

当实验涉及大量样本，或对结果的客观性和重复性要求极高时，自动监测是更佳选择。特别是对于不熟悉所用细胞类型的血管生成行为时，通常会在 24 小时内每 5 - 15 分钟自动拍摄一次照片，以精准监控管形成进程。而若实验规模较小，对结果的详细观察和分析要求较高，且实验室资源有限，手动监测也能满足需求。

3. 无血管生成如何处理？

l 可能原因包括：细胞老化、细胞损伤导致细胞状态不佳、细胞密度过高或过低，或基质胶浓度不合适、过期或质量不佳。

l 解决方案：对于细胞状态不佳的情况，可更换健康细胞或使用代数较低的细胞；针对细胞密度问题，应确保用于血管生成实验的细胞均匀分布且密度适中，由于最佳接种密度具有细胞类型特异性，需通过多次摸索确定；用于实验的培养基应与接种细胞时所使用培养基成分相同，换液时动作要轻柔，以免影响细胞状态；对于基质胶质量问题，可通过重新稀释、更换品牌或批次等方式，确保使用新鲜、质量良好的基质胶。

4. 怎样操作可使基质胶铺板均匀？

l 体积校准：通过标尺纸验证凝胶体积（合适体积时标尺无缩放效应）。

l 基质胶需保存于-20℃，使用时在4℃融化，铺板操作需在冰上进行，以减缓凝固速度。

l 向孔内加入基质胶时应尽可能垂直加入，防止基质胶流经孔壁留下残留胶，并尽量一次性将基质胶铺垫均匀，避免多次加减试剂。

l 在37℃放置固化时，确保放置在水平平面上，以保证实验的准确性和稳定性。

5. 血管生成实验对照组设置

在初次进行血管生成实验时，最少应设置三组对照，具体如下：

l 空白对照组：可以是不含细胞的基质对照组，用于排除基质自身可能带来的背景信号或结构干扰；也可以是仅含有细胞而未进行基质铺板的组别。

l 阳性对照组：需向其中加入已知的促进血管形成物质，在正确的实验条件下应能观察到明显的管状结构形成。

l 阴性对照组：可使用未经任何处理的细胞，或向其中加入已知的血管形成抑制剂。

若实验目的是测试某种药物或化合物对管形成的影响，还需设置不同浓度的该物质作为对照组，同时包括一个无药物处理的对照组，以此评估药物剂量与效果之间的关系。

6. 内皮细胞培养聚团应对策略

内皮细胞在培养过程聚团可能由以下多种因素引起：

l 细胞密度过高或铺板不均匀：可根据实验需求调整细胞接种密度，充分混匀细胞悬液，铺板时动作轻柔、均匀，确保细胞均匀分布。

l 细胞状态不佳或老化：应定期检查细胞状态，及时进行传代操作，避免细胞过度密集培养，以维持细胞的健康状态。

l 基质胶质量差：质量不佳或处理不当的基质胶可能导致细胞无法均匀铺展，需确保基质胶新鲜且严格按照说明书要求进行正确处理。

l 血清促贴壁因子缺乏：建议使用新鲜培养基，或更换为内皮细胞专用培养基，以提供足够的促贴壁因子。