独特的PCR优化体系,使2× Real PCR EasyTM Mix-SYBR具有更强的兼容性。
热启动Foregene Taq Polymerase,具有更高的扩增效率、更高的扩增灵敏度、更高的扩增特异性。
优化的2× Real PCR EasyTM Mix使SYBR Green I具有更高的检测灵敏性,其荧光强度为同类产品的3-5倍,可满足不同类型的荧光定量实验需求。
本产品附带有ROX内参染料,可用于消除信号本底及孔间信号误差,方便客户用于不同型号定量PCR仪使用。
产品介绍
Real Time PCR EasyTM-SYBRGreen I试剂盒提供的2× Real PCR EasyTM Mix-SYBR是一种使用SYBR Green I进行Real Time PCR扩增反应的全新预混系统,能大幅度提高产物特异性和反应灵敏度。同时,提供ROX作为内参染料。该试剂盒的荧光强度为同类产品的3-5倍,能更灵敏的、更直观的反应目的模板DNA的浓度。
2× Real PCR EasyTM Mix-SYBR包含本公司特有的热启动ForegeneTaq DNA Polymerase,该酶相对于普通Taq酶具有扩增效率高、特异性扩增能力强、错配率低等优点。用于荧光定量PCR反应可减少非特异性扩增,提高PCR的准确性。
试剂盒应用
荧光定量PCR进行模板定量分析/常规PCR扩增。
试剂盒内容
2× Real PCR EasyTM Mix-SYBR:包含福际生物特别改造的热启动Taq DNA Polymerase、MgCl2、优化配比的dNTPs和SYBR Green I、反应缓冲液、PCR反应增强剂、优化剂以及稳定剂等。PCR反应时,只需将适当的裂解混合液、引物、DNase-ddH2O添加到2× Real PCR EasyTM Mix-SYBR中即可用于PCR反应。
ROX Reference Dye:一般用于ABI、Stratagene等公司的Real Time PCR扩增仪上,用于调整PCR加样误差所引起的 PCR管与管之间的差异。不同仪器所需ROX Reference Dye浓度不同,用户可以根据仪器的推荐浓度添加。
DNase-Free ddH2O:超纯水,用于
试剂盒原理
试剂盒使用了热启动Foregene Taq DNA Polymerase进行PCR扩增,通过检测反应液中SYBRGreen I的荧光强度,达到监控PCR产物扩增量的目的。在PCR反应体系中,加入过量SYBRGreen I荧光染料,SYBR Green I荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBRGreen I染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBRGreen I与双链DNA结合后发出荧光,可以通过检测反应体系中的SYBRGreen I荧光强度,达到检测PCR产物扩增量的目的。
Real Time PCR引物设计原则
Forward Primer和Reverse Primer
进行Real TimePCR,引物设计非常重要。引物关系到PCR扩增的特异性、高效性等,可以参照以下原则进行引物设计:
u 引物长度:18-30bp。
u GC含量:40-60%。
u Tm值:引物设计软件,如Primer 5,可以给出引物的Tm值。上下游引物的Tm值应 尽量接近。也可以使用Tm计算公式:Tm=4℃(G+C)+2℃(A+T)。进行PCR时,一般选择低于引物Tm值5℃的温度作为退火温度(相应的提高退火温度可以增加PCR反应的特异性)。
u 引物及PCR产物:
v 设计引物PCR扩增产物长度zui好在100-150bp。
v 应尽量避开在模板的二级结构区域设计引物。
v 避免上下游引物3’端之间形成2个或2个以上的互补碱基。
v 引物3’端碱基不能存在多余3个连续的G或C。
v 引物自身不能存在互补结构,否则会形成发夹结构,影响PCR扩增。
v 引物序列中ATCG应尽量分布均匀,3’端碱基避免为T。
Probe
探针选择要保守,引物选择要保守,因此必须找一段100-200bp相对要保守的片段来设计引物与探针。即real-time PCR的扩增片段是50bp-150bp。当找不到150bp的保守片段时,必须确保探针的片段是保守的。一般按照以下原则进行Probe的设计:
u 探针位置尽可能地靠近上游引物。
u 探针长度应在15-45bp(zui好是20-30bp),以保证结合特异性。
u 检测探针的DNA折叠和二级结构。
u Tm值在65-70℃,通常比引物TM值高5-10℃(至少要5℃),GC含量在40%-70%。
u 探针的5’端应避免使用G鸟嘌呤——因为5’G会有淬灭作用,而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用。
u 整条探针中,碱基C的含量要明显高于G的含量——G含量高会降低反应效率,这时就应选择配对的另一条链作为探针。
u 为确保引物探针的特异性,zui好将设计好的序列在blast中核实一次,如果发现有非特异性互补区,建议重新设计引物探针。
无扩增信号
Answer
1. 试剂盒保存不当导致SYBR失效或者试剂盒过期导致SYBR荧光信号丢失。
建议:试剂盒打开后,其中的试剂要避光-20℃保存,且不能经常冻融;购买新的Real Time PCR Kit试剂盒进行相关实验。
2. 试剂盒中的Taq DNA Polymerase因试剂盒保存不当或过期而失去活性。
建议:确认试剂盒的保存条件;重新在PCR体系中添加适量Taq DNA Polymerase或者购买新的Real Time PCR Kit试剂盒进行相关实验。
3. DNA模板中存在大量的Taq DNA Polymerase的抑制因子。
建议:重新纯化模板或降低模板的使用量。
4. Mg2+浓度不适合。
建议:我们提供的2× Real PCR Mix的Mg2+浓度为3.5 mM。但针对有些特殊的引物和模板可能需要的Mg2+浓度较高,因此可直接添加MgCl2进行Mg2+浓度的优化,建议每次增加0.5mM的Mg2+进行优化。
5. PCR扩增条件不适合、引物序列或者浓度不当。
建议:确认引物序列的正确性以及引物没有降解;扩增信号不好时,可尝试降低退火温度,适当调整引物浓度等。
6. 模板用量问题,太少或过多。
建议:可进行模板线性化梯度稀释,选择PCR效果zui好的模板浓度进行Real Time PCR实验。
NTC出现过高的荧光值
Answer
1. 在操作过程中导致的试剂污染。
建议:更换新的试剂进行Real Time PCR实验。
2. PCR反应体系配制时发生污染。
建议:操作时进行必要的防护措施,比如:戴乳胶手套,使用带滤芯的枪头等。
3. 引物出现降解,引物降解会导致非特异性扩增出现。
建议:可使用SDS-PAGE电泳检测引物是否降解,更换新的引物进行Real Time PCR实验。
出现引物二聚体或非特异性扩增
Answer
1. Mg2+浓度不适合。
建议:我们提供的2× Real PCR EasyTM Mix的Mg2+浓度为3.5 mM。但针对有些特殊的引物和模板可能需要的Mg2+浓度较高,因此可直接添加MgCl2进行Mg2+浓度的优化,建议每次增加0.5mM的Mg2+进行优化。
2. PCR退火温度过低。
建议:每次增加1℃或者2℃进行PCR退火温度的优化。
3. PCR产物太长。
建议:Real Time PCR产物长度zui好在100-150bp之间,不要超过500bp。
4. 引物出现降解,引物降解会导致很会飞特异性扩增出现。
建议:可使用SDS-PAGE电泳检测引物是否降解,更换新的引物进行Real Time PCR实验。
5. PCR体系不当,或体系太小。
建议:PCR反应体系太小会导致检测精度降低。zui好使用定量PCR仪推荐的反应体系重新进行Real Time PCR实验。
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定量值重复性差
Answer
1. 仪器故障。
建议:仪器的每一个PCR孔之间可能存在误差,在温度管理或检测时产生重现性较差现象。请根据相应仪器的说明书进行点检。
2. 样品纯度不好。
建议:样品不纯会导致实验的重复性较差,这包括模板、引物的纯度。最好进行模板的再纯化,引物最好使用SDS-PAGE纯化。
3. PCR体系配制放置时间过长。
建议:Real Time PCR体系配制好后立即用于PCR实验,不要搁置太长时间。
4. PCR扩增条件不适合、引物序列或者浓度不当。
建议:确认引物序列的正确性以及引物没有降解;扩增信号不好时,可尝试降低退火温度,适当调整引物浓度等。
5. PCR体系不当,或体系太小。
建议:PCR反应体系太小会导致检测精度降低。最好使用定量PCR仪推荐的反应体系重新进行Real Time PCR实验。