- ￥827
- foregene
- QP-01012
- 中国
- 2025年10月16日
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- 技术资料
- 保质期：
荧光定量PCR试剂盒-SYBR Green I染料法
- 供应商：
500 × 20 μL rxns
- 英文名：
Real Time PCR Kit -（SYBR Green Ⅰ）
- 库存：
荧光定量PCR试剂盒-SYBR Green I染料法
- 规格：
500 × 20 μL rxns
荧光定量PCR试剂盒-SYBR Green I染料法
Real Time PCR EasyTM-SYBR Green I
独特的PCR优化体系，使2× Real PCR EasyTM Mix-SYBR具有更强的兼容性。
热启动Foregene Taq Polymerase，具有更高的扩增效率、更高的扩增灵敏度、更高的扩增特异性。
优化的2× Real PCR EasyTM Mix使SYBR Green I具有更高的检测灵敏性，其荧光强度为同类产品的3-5倍，可满足不同类型的荧光定量实验需求。
本产品附带有ROX内参染料，可用于消除信号本底及孔间信号误差，方便客户用于不同型号定量PCR仪使用。
产品介绍
Real Time PCR EasyTM-SYBRGreen I试剂盒提供的2× Real PCR EasyTM Mix-SYBR是一种使用SYBR Green I进行Real Time PCR扩增反应的全新预混系统，能大幅度提高产物特异性和反应灵敏度。同时，提供ROX作为内参染料。该试剂盒的荧光强度为同类产品的3-5倍，能更灵敏的、更直观的反应目的模板DNA的浓度。
2× Real PCR EasyTM Mix-SYBR包含本公司特有的热启动ForegeneTaq DNA Polymerase，该酶相对于普通Taq酶具有扩增效率高、特异性扩增能力强、错配率低等优点。用于荧光定量PCR反应可减少非特异性扩增，提高PCR的准确性。
试剂盒应用
荧光定量PCR进行模板定量分析/常规PCR扩增。
试剂盒内容
2× Real PCR EasyTM Mix-SYBR：包含福际生物特别改造的热启动Taq DNA Polymerase、MgCl2、优化配比的dNTPs和SYBR Green I、反应缓冲液、PCR反应增强剂、优化剂以及稳定剂等。PCR反应时，只需将适当的裂解混合液、引物、DNase-ddH2O添加到2× Real PCR EasyTM Mix-SYBR中即可用于PCR反应。
ROX Reference Dye：一般用于ABI、Stratagene等公司的Real Time PCR扩增仪上，用于调整PCR加样误差所引起的 PCR管与管之间的差异。不同仪器所需ROX Reference Dye浓度不同，用户可以根据仪器的推荐浓度添加。
DNase-Free ddH2O：超纯水，用于
试剂盒原理
试剂盒使用了热启动Foregene Taq DNA Polymerase进行PCR扩增，通过检测反应液中SYBRGreen I的荧光强度，达到监控PCR产物扩增量的目的。在PCR反应体系中，加入过量SYBRGreen I荧光染料，SYBR Green I荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBRGreen I染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBRGreen I与双链DNA结合后发出荧光，可以通过检测反应体系中的SYBRGreen I荧光强度，达到检测PCR产物扩增量的目的。
Real Time PCR引物设计原则
Forward Primer和Reverse Primer
进行Real TimePCR，引物设计非常重要。引物关系到PCR扩增的特异性、高效性等，可以参照以下原则进行引物设计：
u 引物长度：18-30bp。
u GC含量：40-60%。
u Tm值：引物设计软件，如Primer 5，可以给出引物的Tm值。上下游引物的Tm值应 尽量接近。也可以使用Tm计算公式：Tm=4℃(G+C)+2℃(A+T)。进行PCR时，一般选择低于引物Tm值5℃的温度作为退火温度（相应的提高退火温度可以增加PCR反应的特异性）。
u 引物及PCR产物：
v 设计引物PCR扩增产物长度zui好在100-150bp。
v 应尽量避开在模板的二级结构区域设计引物。
v 避免上下游引物3’端之间形成2个或2个以上的互补碱基。
v 引物3’端碱基不能存在多余3个连续的G或C。
v 引物自身不能存在互补结构，否则会形成发夹结构，影响PCR扩增。
v 引物序列中ATCG应尽量分布均匀，3’端碱基避免为T。
Probe
探针选择要保守，引物选择要保守，因此必须找一段100-200bp相对要保守的片段来设计引物与探针。即real-time PCR的扩增片段是50bp-150bp。当找不到150bp的保守片段时，必须确保探针的片段是保守的。一般按照以下原则进行Probe的设计：
u 探针位置尽可能地靠近上游引物。
u 探针长度应在15-45bp(zui好是20-30bp)，以保证结合特异性。
u 检测探针的DNA折叠和二级结构。
u Tm值在65-70℃，通常比引物TM值高5-10℃(至少要5℃)，GC含量在40%-70%。
u 探针的5’端应避免使用G鸟嘌呤——因为5’G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用。
u 整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量——G含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。
u 为确保引物探针的特异性，zui好将设计好的序列在blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。
无扩增信号
Answer
1. 试剂盒保存不当导致SYBR失效或者试剂盒过期导致SYBR荧光信号丢失。
建议：试剂盒打开后，其中的试剂要避光-20℃保存，且不能经常冻融；购买新的Real Time PCR Kit试剂盒进行相关实验。
2. 试剂盒中的Taq DNA Polymerase因试剂盒保存不当或过期而失去活性。
建议：确认试剂盒的保存条件；重新在PCR体系中添加适量Taq DNA Polymerase或者购买新的Real Time PCR Kit试剂盒进行相关实验。
3. DNA模板中存在大量的Taq DNA Polymerase的抑制因子。
建议：重新纯化模板或降低模板的使用量。
4. Mg2+浓度不适合。
建议：我们提供的2× Real PCR Mix的Mg2+浓度为3.5 mM。但针对有些特殊的引物和模板可能需要的Mg2+浓度较高，因此可直接添加MgCl2进行Mg2+浓度的优化，建议每次增加0.5mM的Mg2+进行优化。
5. PCR扩增条件不适合、引物序列或者浓度不当。
建议：确认引物序列的正确性以及引物没有降解；扩增信号不好时，可尝试降低退火温度，适当调整引物浓度等。
6. 模板用量问题，太少或过多。
建议：可进行模板线性化梯度稀释，选择PCR效果zui好的模板浓度进行Real Time PCR实验。
NTC出现过高的荧光值
Answer
1. 在操作过程中导致的试剂污染。
建议：更换新的试剂进行Real Time PCR实验。
2. PCR反应体系配制时发生污染。
建议：操作时进行必要的防护措施，比如：戴乳胶手套，使用带滤芯的枪头等。
3. 引物出现降解，引物降解会导致非特异性扩增出现。
建议：可使用SDS-PAGE电泳检测引物是否降解，更换新的引物进行Real Time PCR实验。
出现引物二聚体或非特异性扩增
Answer
1. Mg2+浓度不适合。
建议：我们提供的2× Real PCR EasyTM Mix的Mg2+浓度为3.5 mM。但针对有些特殊的引物和模板可能需要的Mg2+浓度较高，因此可直接添加MgCl2进行Mg2+浓度的优化，建议每次增加0.5mM的Mg2+进行优化。
2. PCR退火温度过低。
建议：每次增加1℃或者2℃进行PCR退火温度的优化。
3. PCR产物太长。
建议：Real Time PCR产物长度zui好在100-150bp之间，不要超过500bp。
4. 引物出现降解，引物降解会导致很会飞特异性扩增出现。
建议：可使用SDS-PAGE电泳检测引物是否降解，更换新的引物进行Real Time PCR实验。
5. PCR体系不当，或体系太小。
建议：PCR反应体系太小会导致检测精度降低。zui好使用定量PCR仪推荐的反应体系重新进行Real Time PCR实验。
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定量值重复性差
Answer
1. 仪器故障。
建议：仪器的每一个PCR孔之间可能存在误差，在温度管理或检测时产生重现性较差现象。请根据相应仪器的说明书进行点检。
2. 样品纯度不好。
建议：样品不纯会导致实验的重复性较差，这包括模板、引物的纯度。最好进行模板的再纯化，引物最好使用SDS-PAGE纯化。
3. PCR体系配制放置时间过长。
建议：Real Time PCR体系配制好后立即用于PCR实验，不要搁置太长时间。
4. PCR扩增条件不适合、引物序列或者浓度不当。
建议：确认引物序列的正确性以及引物没有降解；扩增信号不好时，可尝试降低退火温度，适当调整引物浓度等。
5. PCR体系不当，或体系太小。
建议：PCR反应体系太小会导致检测精度降低。最好使用定量PCR仪推荐的反应体系重新进行Real Time PCR实验。
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