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- 以Oct-4基因为例，和元以人基因组为模板扩增Oct-4启动子序列并构建入pGL3-basic载体萤光素酶报告基因上游。根据萤光素酶的表达水平检测Oct-4启动子转录活性
- 上海
- 2025年12月30日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 服务名称：
和元生物目的基因调取
- 提供商：
OBiO和元生物
- 规格：
按服务周期算
人Oct-4启动子报告基因载体构建
摘要： 和元以人基因组为模板扩增Oct-4启动子序列并构建入pGL3-basic载体萤光素酶报告基因上游。根据萤光素酶的表达水平检测Oct-4启动子转录活性。
关键词：Oct-4，启动子， 转录活性， luciferase， 报告基因
一、实验原理
和元PCR扩增Oct-4启动子序列，构建于pGL3-basic载体luciferase上游。根据萤光素酶的表达水平检测Oct-4启动子转录活性。pGL3-basic载体图谱如下：
二、实验目的
和元构建用于检测Oct-4启动子活性的载体质粒。
三、实验方法
和元以人基因组DNA为模板扩增Oct-4启动子序列与经Mlu I和Xho I酶切后的pGL3-basic载体片段同源重组后转化E.coli感受态细胞。用菌落PCR鉴定转化子，筛选到的阳性克隆送测序。测序无误的克隆进行质粒抽提。实验步骤如下：
1. 引物设计：
和元从GenBank中查询目的基因上下游的序列，用VectorNTI软件进行引物设计。
PCR扩增目的片段：
使用高保真的PrimeSTAR酶扩增目的片段，反应体系和条件如下：
2. 琼脂糖凝电泳检测PCR扩增结果：
和元在目的片段PCR扩增成功后，进行琼脂糖凝电泳检测①，通过和DNA Maker的对比，判断目的片段是否扩增成功。
3. 胶回收目的片段：
和元把目的片段条带从琼脂糖凝电泳后的胶中割下来，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收，具体步骤参考试剂盒说明书。
4. 线性化表达载体的制备：
和元用限制性内切酶对检测载体的进行酶切，酶切反应体系为：质粒2μg， 10 x反应Buffer 5μL，限制性内切酶各1μL，用水补足50μL，于37℃水浴锅中孵育2h以上。酶切产物进行琼脂糖凝电泳检测酶切效果，并把目的载体条带从琼脂糖凝电泳后的胶中割下来，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收。
5. 目的片段同源重组到线性化检测载体中：
6. 感受态细胞的制备和转化：
DH5α感受态细胞的制备和转化，详见《精编分子生物学实验指南》②
7. 菌落PCR鉴定阳性转化子：
和元挑取平板上长出的转化子重悬于10µl LB培养液中，取1µl做模板进行菌落PCR鉴定。反应体系和PCR循环条件如下：
8. 阳性克隆送测序：
和元将菌落鉴定得到的阳性克隆，送公司进行测序验证。软件比对测序结果并分析。
9. 质粒小提：
和元的测序通过阳性克隆，安排质粒小提。具体步骤见试剂盒说明书。
四、和元实验结果
1. 和元PCR扩增目的片段：
用正向引物GTTTATCGATACGCGTTTCCCATGTCAAGTAAGGG（引物说明：含同源重组序列、Mlu I酶切位点，并含有目的基因5’端配对序列用于PCR扩增目的基因），反向引物GAAGCTTGAGCTCGAGGGGAAGGAAGGCGCCC（引物说明：含同源重组序列、Xho I酶切位点下划线标记的，并含有目的基因3’端配对序列用于PCR扩增目的基因）对人基因组DNA进行扩增，预期PCR产物大小为3948 bp，电泳结果如下：
1kb DNA ladder Marker：10 kb、8kb、6kb、5kb、4 kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、•1.5kb、1kb、750 bp、500 bp、250 bp
2. 和元检测载体的线性化
用Mlu I和Xho I对检测载体进行双酶切，胶回收4801bp的载体片段，酶切图谱如下：
第一泳道：空质粒；第二泳道：1kb DNA ladder Marker：10 kb、8kb、6kb、5kb、4 kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750 bp、500 bp、250 bp；第三泳道：经Mlu I和Xho I酶切后的pGL3-basic载体
3. 和元菌落PCR鉴定阳性克隆
用菌落PCR鉴定转化子，正向引物Oct-4-F GCCTACCGTGGTATTAGATGTC位于目的基因序列中，反向引物Luc-N-R CCTTATGCAGTTGCTCTCC位于萤光素酶基因的N端序列，阳性克隆得到1324bp的片段。电泳结果如下：
1. 阴性对照（H2O） 2. 阳性对照（GAPDH） 3. DL2,000 DNA Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp 4-11. 挑取的8个转化子 接种阳性克隆，保种并分装100μL送测序。测序没有问题的，再接种抽提质粒。
4. 和元测序结果分析
阳性克隆测序结果表明，和预期序列完全一致。
五、和元参考文献
1. F.M.奥斯伯等著，马学军等译，精编分子生物学实验指南（第四版），科学出版社，P57~58
2. F.M.奥斯伯等著，马学军等译，精编分子生物学实验指南（第四版），科学出版社，P25~26
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一种或者两种适当的限制酶切割，分别产生对称性粘性末端（用一种限制性内切酶进行消化而产生带有互补突出端）、不对称粘性末端（用两种不同的限制性内切酶进行消化而产生带有非互补突出端）、平端。在亚克隆时，首选不对称相容末端连接，次选对称性粘性相容性末端连接，由于平末端连接效率较低，通常很少采用。但有时目的片段的末端与载体不匹配 ，一般先将不匹配末端补平，然后再以平末端连接。（实验操作同前述）三、利用T4 DNA连接酶进行目的DNA片段和载体的体外连接（一）连接要求和结果外源DNA片段末端性质连接要求
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