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基因过表达载体构建

基因过表达载体构建
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供应商信息

和元生物技术(上海)股份有限公司
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产品详情

地区: 上海
简介: 和元以Oct-4以例,cDNA为模板扩增Oct-4基因并构建入慢病毒载体pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro。该载体骨架中EGFP-3FLAG与目的基因融合表达以利于后续的表达观测和Western Blot研究,而puromycin抗性基因则利于稳定细胞株的
提供商: 和元生物
服务名称: 和元过表达基因载体构建(过表达质粒构建)
规格: 按周期

人Oct-4过表达载体构建

摘要:和元上海以cDNA为模板,扩增Oct-4基因并构建入慢病毒载体pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro。该载体骨架中EGFP-3FLAG与目的基因融合表达以利于后续的表达观测和Western Blot研究,而puromycin抗性基因则利于稳定细胞株的筛选。该载体既可用于瞬时转染细胞,也可以包装成慢病毒用于稳定株的筛选以及在动物水平过表达Oct-4基因。

关键词:Oct-4,过表达, EGFP-3FLAG, puromycin, lentivirus vector

一、 实验原理
和元PCR扩增Oct-4基因序列,构建于pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro载体CMV-EGFP序列间的EcoR I多克隆位点,目的基因和EGFP-3FLAG序列融合表达。pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro载体图谱如下:

 

二、 实验目的
和元构建既可用于瞬时转染又可用于稳定株筛选的Oct-4基因过表达慢病毒载体.

三、 实验方法
和元PCR扩增的Oct-4基因序列与经由EcoR I酶切后的表达载体pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro片段同源重组后转化E.coli  DH5α感受态细胞。菌落PCR筛选到的阳性克隆送测序。经验证无误的进行质粒抽提。实验步骤如下:
1. 引物设计:
和元从GenBank中查询目的基因以及上下游的序列,用VectorNTI软件进行引物设计。PCR扩增目的基因:
使用高保真的PrimeSTAR酶扩增目的基因,反应体系和条件如下:
 

 
2. 琼脂糖凝电泳检测PCR扩增结果:
和元目的基因PCR扩增成功后,进行琼脂糖凝电泳检测①,通过和DNA Maker的对比,判断目的基因是否扩增成功。
3. 胶回收目的基因片段:
和元把目的基因条带从琼脂糖凝电泳后的胶中割下来,用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收,具体步骤步骤参考试剂盒说明书。
4. 线性化表达载体的制备:
和元用限制性内切酶对表达载体的进行酶切,酶切反应体系为:质粒2μg,10 x反应Buffer 5μL,限制性内切酶各1μL,用水补足50μL,于37℃水浴锅中孵育2h以上。酶切产物进行进行琼脂糖凝电泳检测酶切效果,并把目的载体条带从琼脂糖凝电泳后的胶中割下来,用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收。
5. 目的基因同源重组到线性化表达载体中:


6. 感受态细胞的制备和转化:
和元DH5α感受态细胞的制备和转化,详见《精编分子生物学实验指南》②
7. 菌落PCR鉴定阳性转化子:
和元挑取平板上长出的转化子重悬于10µl LB培养液中,取1µl做模板进行菌落PCR鉴定。反应体系和PCR循环条件如下:

 

8. 阳性克隆送测序:
和元菌落鉴定得到的阳性克隆,送公司进行测序验证。软件比对测序结果并分析。
9. 质粒小提:
和元测序通过的阳性克隆,安排质粒小提。具体步骤见试剂盒说明书。

四、和元实验结果
1. PCR扩增目的基因:
和元用正向引物CTCAAGCTTCGAATTCGCCACCATGGCGGGACACCTGGCT(含同源重组序列、EcoR I酶切位点、Kozak序列,并含有目的基因5’端配对序列用于PCR扩增目的基因),反向引物CCATGGTGGCGAATTCGTTTGAATGCATGGGAGAGC(引物说明:含同源重组序列、EcoR I酶切位点,并含有目的基因3’端配对序列用于PCR扩增目的基因)对人cDNA进行扩增,预期PCR产物大小为1126 bp,电泳结果如下:

DL2,000 DNA  Marker: 2 kb, 1 kb,750 bp,500 bp,250 bp,100 bp

2. 表达载体的线性化
和元用EcoR I对表达载体进行双酶切,胶回收4801bp的载体片段,酶切图谱如下:

  
    
                                                              
 1kb DNA ladder Marker:10 kb、8kb、6kb、5kb、4 kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、•1.5kb、1kb、750 bp、500 bp、250 bp

3. 菌落PCR鉴定阳性克隆
和元用菌落PCR鉴定转化子,正向引物CMV-F   CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG位于CMV启动子序列中,反向引物pEGFP-N-3   CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG位于EGFP基因的N端序列,阳性克隆得到1287bp的片段,空载体对照得到252bp的片断。电泳结果如下:
                                                              

1. 阴性对照(H2O)
2. 阴性对照(空载体)
3. DL2,000 DNA  Marker: 2 kb, 1 kb,750 bp,500 bp,250 bp,100 bp  4~11   挑取的8个转化子接种阳性克隆,保种并分装100μL送测序。经验证序列无误的,抽提质粒。
4. 和元测序结果分析
阳性克隆测序结果表明,和预期序列完全一致。

 

五、和元参考文献

1. F.M.奥斯伯等著,马学军等译,精编分子生物学实验指南(第四版),科学出版社,P57~58

2. F.M.奥斯伯等著,马学军等译,精编分子生物学实验指南(第四版),科学出版社,P25~26

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