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基因过表达载体构建

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基因过表达载体构建
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  • 和元以Oct-4以例,cDNA为模板扩增Oct-4基因并构建入慢病毒载体pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro。该载体骨架中EGFP-3FLAG与目的基因融合表达以利于后续的表达观测和Western Blot研究,而puromycin抗性基因则利于稳定细胞株的
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  • 提供商: 和元生物
    服务名称: 和元过表达基因载体构建(过表达质粒构建)
    规格: 按周期

    人Oct-4过表达载体构建

    摘要:和元上海以cDNA为模板,扩增Oct-4基因并构建入慢病毒载体pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro。该载体骨架中EGFP-3FLAG与目的基因融合表达以利于后续的表达观测和Western Blot研究,而puromycin抗性基因则利于稳定细胞株的筛选。该载体既可用于瞬时转染细胞,也可以包装成慢病毒用于稳定株的筛选以及在动物水平过表达Oct-4基因。

    关键词:Oct-4,过表达, EGFP-3FLAG, puromycin, lentivirus vector

    一、 实验原理
    和元PCR扩增Oct-4基因序列,构建于pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro载体CMV-EGFP序列间的EcoR I多克隆位点,目的基因和EGFP-3FLAG序列融合表达。pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro载体图谱如下:

     

    二、 实验目的
    和元构建既可用于瞬时转染又可用于稳定株筛选的Oct-4基因过表达慢病毒载体.

    三、 实验方法
    和元PCR扩增的Oct-4基因序列与经由EcoR I酶切后的表达载体pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro片段同源重组后转化E.coli  DH5α感受态细胞。菌落PCR筛选到的阳性克隆送测序。经验证无误的进行质粒抽提。实验步骤如下:
    1. 引物设计:
    和元从GenBank中查询目的基因以及上下游的序列,用VectorNTI软件进行引物设计。PCR扩增目的基因:
    使用高保真的PrimeSTAR酶扩增目的基因,反应体系和条件如下:
     

     
    2. 琼脂糖凝电泳检测PCR扩增结果:
    和元目的基因PCR扩增成功后,进行琼脂糖凝电泳检测①,通过和DNA Maker的对比,判断目的基因是否扩增成功。
    3. 胶回收目的基因片段:
    和元把目的基因条带从琼脂糖凝电泳后的胶中割下来,用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收,具体步骤步骤参考试剂盒说明书。
    4. 线性化表达载体的制备:
    和元用限制性内切酶对表达载体的进行酶切,酶切反应体系为:质粒2μg,10 x反应Buffer 5μL,限制性内切酶各1μL,用水补足50μL,于37℃水浴锅中孵育2h以上。酶切产物进行进行琼脂糖凝电泳检测酶切效果,并把目的载体条带从琼脂糖凝电泳后的胶中割下来,用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收。
    5. 目的基因同源重组到线性化表达载体中:


    6. 感受态细胞的制备和转化:
    和元DH5α感受态细胞的制备和转化,详见《精编分子生物学实验指南》②
    7. 菌落PCR鉴定阳性转化子:
    和元挑取平板上长出的转化子重悬于10µl LB培养液中,取1µl做模板进行菌落PCR鉴定。反应体系和PCR循环条件如下:

     

    8. 阳性克隆送测序:
    和元菌落鉴定得到的阳性克隆,送公司进行测序验证。软件比对测序结果并分析。
    9. 质粒小提:
    和元测序通过的阳性克隆,安排质粒小提。具体步骤见试剂盒说明书。

    四、和元实验结果
    1. PCR扩增目的基因:
    和元用正向引物CTCAAGCTTCGAATTCGCCACCATGGCGGGACACCTGGCT(含同源重组序列、EcoR I酶切位点、Kozak序列,并含有目的基因5’端配对序列用于PCR扩增目的基因),反向引物CCATGGTGGCGAATTCGTTTGAATGCATGGGAGAGC(引物说明:含同源重组序列、EcoR I酶切位点,并含有目的基因3’端配对序列用于PCR扩增目的基因)对人cDNA进行扩增,预期PCR产物大小为1126 bp,电泳结果如下:

    DL2,000 DNA  Marker: 2 kb, 1 kb,750 bp,500 bp,250 bp,100 bp

    2. 表达载体的线性化
    和元用EcoR I对表达载体进行双酶切,胶回收4801bp的载体片段,酶切图谱如下:

      
        
                                                                  
     1kb DNA ladder Marker:10 kb、8kb、6kb、5kb、4 kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、•1.5kb、1kb、750 bp、500 bp、250 bp

    3. 菌落PCR鉴定阳性克隆
    和元用菌落PCR鉴定转化子,正向引物CMV-F   CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG位于CMV启动子序列中,反向引物pEGFP-N-3   CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG位于EGFP基因的N端序列,阳性克隆得到1287bp的片段,空载体对照得到252bp的片断。电泳结果如下:
                                                                  

    1. 阴性对照(H2O)
    2. 阴性对照(空载体)
    3. DL2,000 DNA  Marker: 2 kb, 1 kb,750 bp,500 bp,250 bp,100 bp  4~11   挑取的8个转化子接种阳性克隆,保种并分装100μL送测序。经验证序列无误的,抽提质粒。
    4. 和元测序结果分析
    阳性克隆测序结果表明,和预期序列完全一致。

     

    五、和元参考文献

    1. F.M.奥斯伯等著,马学军等译,精编分子生物学实验指南(第四版),科学出版社,P57~58

    2. F.M.奥斯伯等著,马学军等译,精编分子生物学实验指南(第四版),科学出版社,P25~26

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