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基因过表达载体构建

基因过表达载体构建
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和元生物技术(上海)股份有限公司
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产品详情

地区: 上海
简介: 和元以Oct-4以例,cDNA为模板扩增Oct-4基因并构建入慢病毒载体pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro。该载体骨架中EGFP-3FLAG与目的基因融合表达以利于后续的表达观测和Western Blot研究,而puromycin抗性基因则利于稳定细胞株的
提供商: 和元生物
服务名称: 和元过表达基因载体构建(过表达质粒构建)
规格: 按周期

人Oct-4过表达载体构建

摘要:和元上海以cDNA为模板,扩增Oct-4基因并构建入慢病毒载体pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro。该载体骨架中EGFP-3FLAG与目的基因融合表达以利于后续的表达观测和Western Blot研究,而puromycin抗性基因则利于稳定细胞株的筛选。该载体既可用于瞬时转染细胞,也可以包装成慢病毒用于稳定株的筛选以及在动物水平过表达Oct-4基因。

关键词:Oct-4,过表达, EGFP-3FLAG, puromycin, lentivirus vector

一、 实验原理
和元PCR扩增Oct-4基因序列,构建于pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro载体CMV-EGFP序列间的EcoR I多克隆位点,目的基因和EGFP-3FLAG序列融合表达。pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro载体图谱如下:

 

二、 实验目的
和元构建既可用于瞬时转染又可用于稳定株筛选的Oct-4基因过表达慢病毒载体.

三、 实验方法
和元PCR扩增的Oct-4基因序列与经由EcoR I酶切后的表达载体pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro片段同源重组后转化E.coli  DH5α感受态细胞。菌落PCR筛选到的阳性克隆送测序。经验证无误的进行质粒抽提。实验步骤如下:
1. 引物设计:
和元从GenBank中查询目的基因以及上下游的序列,用VectorNTI软件进行引物设计。PCR扩增目的基因:
使用高保真的PrimeSTAR酶扩增目的基因,反应体系和条件如下:
 

 
2. 琼脂糖凝电泳检测PCR扩增结果:
和元目的基因PCR扩增成功后,进行琼脂糖凝电泳检测①,通过和DNA Maker的对比,判断目的基因是否扩增成功。
3. 胶回收目的基因片段:
和元把目的基因条带从琼脂糖凝电泳后的胶中割下来,用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收,具体步骤步骤参考试剂盒说明书。
4. 线性化表达载体的制备:
和元用限制性内切酶对表达载体的进行酶切,酶切反应体系为:质粒2μg,10 x反应Buffer 5μL,限制性内切酶各1μL,用水补足50μL,于37℃水浴锅中孵育2h以上。酶切产物进行进行琼脂糖凝电泳检测酶切效果,并把目的载体条带从琼脂糖凝电泳后的胶中割下来,用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收。
5. 目的基因同源重组到线性化表达载体中:


6. 感受态细胞的制备和转化:
和元DH5α感受态细胞的制备和转化,详见《精编分子生物学实验指南》②
7. 菌落PCR鉴定阳性转化子:
和元挑取平板上长出的转化子重悬于10µl LB培养液中,取1µl做模板进行菌落PCR鉴定。反应体系和PCR循环条件如下:

 

8. 阳性克隆送测序:
和元菌落鉴定得到的阳性克隆,送公司进行测序验证。软件比对测序结果并分析。
9. 质粒小提:
和元测序通过的阳性克隆,安排质粒小提。具体步骤见试剂盒说明书。

四、和元实验结果
1. PCR扩增目的基因:
和元用正向引物CTCAAGCTTCGAATTCGCCACCATGGCGGGACACCTGGCT(含同源重组序列、EcoR I酶切位点、Kozak序列,并含有目的基因5’端配对序列用于PCR扩增目的基因),反向引物CCATGGTGGCGAATTCGTTTGAATGCATGGGAGAGC(引物说明:含同源重组序列、EcoR I酶切位点,并含有目的基因3’端配对序列用于PCR扩增目的基因)对人cDNA进行扩增,预期PCR产物大小为1126 bp,电泳结果如下:

DL2,000 DNA  Marker: 2 kb, 1 kb,750 bp,500 bp,250 bp,100 bp

2. 表达载体的线性化
和元用EcoR I对表达载体进行双酶切,胶回收4801bp的载体片段,酶切图谱如下:

  
    
                                                              
 1kb DNA ladder Marker:10 kb、8kb、6kb、5kb、4 kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、•1.5kb、1kb、750 bp、500 bp、250 bp

3. 菌落PCR鉴定阳性克隆
和元用菌落PCR鉴定转化子,正向引物CMV-F   CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG位于CMV启动子序列中,反向引物pEGFP-N-3   CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG位于EGFP基因的N端序列,阳性克隆得到1287bp的片段,空载体对照得到252bp的片断。电泳结果如下:
                                                              

1. 阴性对照(H2O)
2. 阴性对照(空载体)
3. DL2,000 DNA  Marker: 2 kb, 1 kb,750 bp,500 bp,250 bp,100 bp  4~11   挑取的8个转化子接种阳性克隆,保种并分装100μL送测序。经验证序列无误的,抽提质粒。
4. 和元测序结果分析
阳性克隆测序结果表明,和预期序列完全一致。

 

五、和元参考文献

1. F.M.奥斯伯等著,马学军等译,精编分子生物学实验指南(第四版),科学出版社,P57~58

2. F.M.奥斯伯等著,马学军等译,精编分子生物学实验指南(第四版),科学出版社,P25~26

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基因过表达/慢病毒包装/慢病毒构建 慢病毒(Lentivirus)是一类改造自人免疫缺陷病毒(HIV)的病毒载体。是一种RNA病毒,可以利用逆转录酶将外源基因整合到基因组中实现稳定长时表达。和元上海提供的慢病毒生产和指控采取了国际学术界公认的标准流程,采用三质粒系统在293T细胞中进行包装。所获得的慢病毒颗粒经过超速离心纯化,并通过qPCR对慢病毒基因拷贝进行滴定。一般情况下我们生产的慢病毒滴度在108~109TU/ml,完全可以满足各类实验的使用要求。服务简介:和元上海根据客户提供的基因信息,从生物信息学网站上调出该基因的cDNA序列,将cDNA序列构建到慢病毒载体,生产的病毒颗粒可以直接用于感染细胞或者动物实验。慢病毒具有感染范围广、持续表达等特点,主要用于难感染的细胞转染,如干细胞、免疫细胞(如DC细胞)和肿瘤细胞等。慢病毒的转染效率高和能持续表达的特点促进了基因表达的效果,可以用来标记和追踪体内的干细胞、肿瘤细胞和白细胞,也可以用作体内的基因传递治疗,或单细胞胚胎制备转基因动物。服务流程:服务优势:对分裂期细胞和非分裂期细胞均有感染作用;操作方便,安全性高;干扰稳定高效;实验周期短;多种载体可选。可供选择的病毒载体: 载体名称 包装容量 载体特点 pLenti-CMV-MCS-EGFP-3FLAG 2.8kb 融合EGFP-3FLAG pLenti-CMV-MCS-EGFP-3FLAG-PGK-puro 1.6kb 融合EGFP-3FLAG,带puro抗性 pLenti-CMV-EGFP-P2A-MCS-3FLAG 2.7kb 带EGFP,融合3FLAG pLenti-CMV-HA-MCS-3FLAG-PGK-EGFP-T2A-puro 1.5kb 带EGFP和puro抗性,融合3FLAG、HA pLenti-CMV-MCS-EGFP-3FLAG-PGK-Zeo 1.8kb 融合EGFP-3FLAG,带Zeo抗性 pLenti-CMV-MCS-EGFP-3FLAG-IRES-puro 1.6kb

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