Puromycin Dihydrochloride 嘌呤霉素

产品描述

嘌呤霉素（Puromycin），来源于白黑链霉菌（Streptomyces alboniger）代谢产物的一种氨基糖苷类抗生素，

有效抑制革兰氏阳性菌生长，对抗酸杆菌的抑制活性相对较弱，但对革兰氏阴性菌的抑制活性更弱。还能抑制原生生物、藻类、哺乳动物和昆虫细胞的生长，一般2天内能杀死99%的细胞。作用机制在于：嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3’末端的结构类似物，能够与核糖体的A位点结合并掺入到延伸肽链中，导致肽链合成的永久终止，进而阻止蛋白质合成。嘌呤霉素还具有抗肿瘤活性。作为蛋白合成抑制剂，用来研究细胞分化中控制基因顺序表达和协同表达的转录调控机制。

对嘌呤霉素的抗性来自嘌呤霉素产生菌内发现的pac基因，其表达产物嘌呤霉素N-乙酰转移酶（puromycin N-acetyl-transferase）可通过乙酰化嘌呤霉素使其失活。这一特性使得嘌呤霉素常用来筛选和维持培养携带pac基因的哺乳动物细胞株，特别是慢病毒感染的细胞株。现在商业化的慢病毒载体多数都携带pac基因。某些情况下，也能用来筛选携带pac基因的大肠杆菌菌株。嘌呤霉素在CRISPR/Cas9基因编辑系统中也发挥重要作用。

本品为嘌呤霉素的二盐算盐形式，CAS NO：58-58-2，粉末形式，可溶于水配制成50mg/ml储存液，0.22µm滤膜过滤除菌后，-20℃冻存。真核细胞常用的筛选浓度为1-10µg/ml。

产品特性

1）   化学名：3′-[α-Amino-p-methoxyhydrocinnamamido]-3′-deoxy-N,N-dimethyladenosine dihydrochloride

2）   同义名：Stylomycin hydrochloride; CL 13900 dihydrochloride; P638 dihydrochloride; CL16536; NSC 3055;

3）   CAS NO：58-58-2

4）   分子式：C22H29N7O5·2HCl

5）   分子量：544.43 g/mol

6）   外观：白色至灰白色粉末

7）   纯度：＞98% (HPLC)

8）   熔点：175-177 °C

9）   溶解性：溶于水（50mg/ml），乙醇（~1mg/ml），DMSO（~10mg/ml），PBS，pH 7.2（~10mg/ml）

保存与运输方法

保存：-20℃干燥保存，4年有效。

运输：冰袋运输。

使用方法

1、  储存液制备

用蒸馏水溶解嘌呤霉素配制成50 mg/ml的储存液，经0.22 μm滤膜过滤除菌，按照单次用量分装，于-20℃冻存，避免反复冻融。也可溶于甲醇，配制成10 mg/ml的储存液。

2、  建议工作浓度

哺乳动物细胞：1-10 μg/ml，最佳浓度使用宿主细胞杀灭实验（杀灭曲线）来确定；

大肠杆菌：LB琼脂培养基筛选敏感转化菌株，使用浓度为100-125μg/ml。

【注意】：使用嘌呤霉素筛选大肠杆菌阳性转化子不仅需精确的pH值调节，而且受宿主细胞本身状态影响。

3、杀灭曲线的建立

嘌呤霉素合适的筛选浓度与细胞类型、生长状态、细胞密度、代谢情况，以及细胞所处周期等因素有关。为了筛选到稳定表达的细胞株，确定杀死未转染或感染细胞所需的最低浓度嘌呤霉素至关重要。建议初次实验一定要建立杀灭曲线（kill curve），筛选到适合自身实验体系的较优筛选浓度。

1）   于24孔板加入500 μl/孔制备好的细胞悬液，铺足够的孔以保证后续的梯度实验。37℃细胞孵育过夜。理想情况开始抗生素筛选时，细胞达到较高的密度（~60-80%），常用的细胞密度如下：

贴壁细胞：0.8 – 3.0 x 105cells/ml

悬浮细胞：2.5 – 5.0 x 105cells/ml

2）   准备筛选培养基：含梯度浓度嘌呤霉素的新鲜培养基（比如，设置0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10μg/ml，这11个筛选浓度，每个浓度2个复孔）；

3）   将孵育过夜的细胞清洗后，更换新鲜制备的梯度筛选培养基；之后置于37℃，5%CO2培养箱内孵育；

4）   根据细胞的生长状态，约2-3天更换新鲜的筛选培养基；

5）   每日监测细胞，观察存活细胞率，从而确定抗生素筛选开始4-6天内有效杀死非转染或者所有非感染细胞的抗生素最低浓度，也就是将用到的较优筛选浓度。

【注意】：如果发现细胞开始变圆但没有从平板表面脱落可能是以下情况，

a）变圆但是未脱落是细胞开始死亡的一个信号，这些需要更长的筛选时间；

b）若在建议浓度1-10μg/ml范围内还不能完全处死细胞，此时需要检测药物是否有效，避免药物的反复冻融（<5）。

注意事项

1）   嘌呤霉素为有毒化合物，操作时需注意防护，切勿与身体或皮肤直接接触。

2）   为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。