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湖北佰莱博科技有限公司
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蛋白质质量表征分析服务
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高分文章 “加速器”！细胞原位 XL-MS 如何破解蛋白互作研究难题？
交联质谱（XL-MS）结合化学交联与高分辨率质谱，用于蛋白组水平研究细胞内蛋白复合物的空间构象和相互作用。实验流程包括蛋白提取与复合物富集、交联反应及肽段酶解、交联肽的富集，以及LC-MS/MS检测与分析。通过高置信度交联肽识别，可系统解析蛋白复合物结构与相互作用网络。
1. XLMS技术简介
在细胞中进行交联质谱（XL-MS）的原理是通过使用多功能、可富集的化学交联剂，这类交联剂不仅能特异性地与蛋白质中的特定官能团（如赖氨酸的伯胺）形成共价键，固定蛋白质之间瞬时或弱的相互作用，同时还携带可供富集或标记的功能基团，使交联肽段能够在复杂消化产物中被选择性捕获。交联后的蛋白质被酶解生成肽段，其中的交联肽段连接了不同蛋白质的残基，携带相互作用界面及空间构象信息。通过亲和捕获或物理化学方法对这些可富集的交联肽段进行选择性富集，可以显著提高其在液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析中的检测灵敏度和覆盖率。随后，通过质谱数据结合专用软件识别交联肽段及其交联位点，从而解析细胞内蛋白质复合物的结构、相互作用及空间组织信息。
2. XLMS技术基本流程（以Azide-DSBSO交联剂为例）
（1）细胞处理与交联
将待分析的细胞培养至适当密度，保持健康状态。加入DSBSO交联剂至细胞培养体系中（0.1~2 mM），使其与细胞内蛋白质赖氨酸侧链发生共价交联，以捕获瞬时或弱的蛋白质-蛋白质相互作用。交联反应结束后，用适当缓冲液终止反应，并收集细胞进行裂解。
（2）蛋白质提取与酶解
对交联后的细胞进行裂解，提取总蛋白质。使用胰蛋白酶对蛋白质进行酶解，产生线性肽段、单端修饰肽段以及交联肽段。酶解条件需保证交联肽段保持完整，同时产生适合LC-MS/MS分析的肽段长度。
（3）交联肽段富集
利用DSBSO分子上的叠氮（Azide）基团，通过 DBCO-偶联的磁珠富集交联肽段。洗去未标记或非特异结合的肽段，提高后续质谱分析的信噪比。
（4）液相色谱-质谱分析（LC-MS/MS）
富集后的交联肽段通过液相色谱进行分离后进入串联质谱（MS/MS）分析，获得肽段精确质量和碎片离子信息。
（5）交联数据分析
利用专用XL-MS数据分析软件（如MS Annika、pLink、XlinkX或Scout）对原始数据进行搜索与鉴定，筛选高置信度的蛋白内与蛋白间交联位点，并用于解析蛋白复合物的空间构象与相互作用模式。
图1 细胞内XLMS技术基本流程图
3. 经典案例解析
案例：利用交联质谱（XL MS）分析K562细胞蛋白互作网络
在体内交联实验中，通过将活细胞（K562细胞或分离的核提取物）与MS可裂解且可富集的Azide A DSBSO交联剂直接反应，捕获细胞内自然存在的蛋白 蛋白相互作用。具体操作中，将2×108个细胞或来自相同数量细胞的核提取物重悬于适宜的缓冲液后，加入DSBSO使终浓度达到约2 mM，在37℃下孵育约1小时进行交联反应，同时在孵育末期加入Benzonase以辅助DNA降解。反应终止后，细胞裂解并通过FASP过滤去除未反应物质，对蛋白进行酶切（先LysC再胰蛋白酶）获得肽段。消化产物先经click反应于DBCO偶联的磁珠上进行亲和富集，然后结合体积排阻色谱（SEC）分级富集交联肽段，选择包含大部分交联肽的SEC分级后，通过Orbitrap Exploris 480质谱仪进行LC-MS/MS检测。用MS Annika 3.0进行交联肽段识别与筛选，控制假发现率以保证交联位点的可信度。
交联质谱结果显示，在K562全细胞和核提取物中分别鉴定到数千个唯一交联位点，构建了一个综合性的蛋白 蛋白互作网络，其中仅细胞核就检测到近400个互作，包含大约56个先前未报道的互作。优化的亲和富集+SEC分级策略能显著提高交联肽检测灵敏度，大约90%的总交联事件可以从单一SEC分级中获得（图2）。此外，对于特定低丰度蛋白（如DDX39B），在核提取物中也能有效检测其交联肽（Bräuer et al., 2025）。
图2 XL-MS在细胞核中鉴定到高覆盖度的蛋白-蛋白交联网络（来自原文Fig.4）
XLMS样品准备要求
可按照如下表格进行样品制备：
|
实验类型 |
样品需求 |
周期 |
交付内容 |
|
纯化蛋白 |
目的蛋白每种30-50 µg |
15个工作日 |
交联位点列表、蛋白交联位点展示图、原始文件、报告 |
|
细胞内蛋白组 |
每个重复≥1×108个细胞，或总蛋白量≥3 mg |
30个工作日 |
备注：
（1）交联剂类型可根据实验需求选择，如DSSO、BS3等。
（2）样品缓冲体系建议无伯胺、低盐且不含甘油（如HEPES或PBS），避免影响交联效率。
（3）纯化蛋白应保证构象稳定且无聚集沉淀；细胞内蛋白组需保证细胞状态健康且重复独立。
（4）样品可冷冻运输，但应避免反复冻融以保证交联效率。
参考文献
Wheat A, Yu C, Wang X, et al. Protein interaction landscapes revealed by advanced in vivo cross-linking-mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021;118(32):e2023360118.
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