磷酸化蛋白质组学实验常见问题及解决方案

蛋白磷酸化是最关键的翻译后修饰之一，广泛参与细胞信号转导、代谢调控、细胞周期等生物过程。随着质谱技术的发展，磷酸化蛋白质组学已成为研究信号通路动态调控机制的重要手段。然而，磷酸化修饰本身的低丰度、不稳定性以及富集效率差等问题，仍然为实验带来诸多挑战。

 

一、磷酸化蛋白样本准备中的常见问题

1、蛋白磷酸化修饰不稳定，样本降解严重

（1）问题描述：

磷酸化位点易受磷酸酶作用脱磷，尤其在样本裂解与处理阶段，极易丢失关键信号。

 

（2）解决方案：

 

• 在裂解液中加入高效磷酸酶抑制剂混合物（如NaF、β-glycerophosphate、Na₃VO₄），并在4°C或冰浴下操作；
• 快速处理样本，缩短裂解到变性时间；
• 尽量避免冻融循环，建议立即裂解并快速冻存（液氮速冻）。

 

2、蛋白提取效率低，影响后续富集

（1）问题描述：

某些膜蛋白或低丰度信号蛋白提取效率低，导致质谱检测不到关键磷酸化肽段。

 

（2）解决方案：

 

• 选择兼顾疏水与亲水蛋白的裂解缓冲液（如8M Urea / 2% SDS 等）；
• 适当引入超声或机械匀浆手段提高裂解效率；
• 使用强效裂解液时需评估对后续酶解与富集步骤的影响。

 

二、酶解与磷酸化肽富集中的难点

1、酶解效率低，磷酸肽产率不足

（1）问题描述：

蛋白酶解不完全会影响磷酸肽段的生成，从而影响质谱识别率。

 

（2）解决方案：

 

• 采用Trypsin/Lys-C联合酶解方案，提高酶解覆盖度；
• 控制合适的酶解时间与温度，避免过度酶解或蛋白降解；
• 可尝试表面活性剂辅助酶解（如RapiGest、SDC）提高效率。

 

2、富集专一性差，背景信号高

（1）问题描述：

TiO₂或IMAC富集过程中，非磷酸肽共沉淀，影响下游数据质量。

 

（2）解决方案：

 

• 优化富集缓冲体系，如加入2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) 或glycolic acid提高TiO₂选择性；
• 控制上样蛋白量与载体材料比例，避免饱和；
• 多次洗涤以剔除非特异性结合物质。

 

三、质谱检测与数据分析中的常见误区

1、MS参数未针对磷酸化优化，灵敏度不足

（1）问题描述：

标准DDA模式下，可能忽略低丰度磷酸肽，或因中性丢失而造成识别率降低。

 

（2）解决方案：

 

• 采用多级串联质谱（MS³）或ETD/HCD联合碎裂方式，提升定位精度；
• 调整质谱仪参数，如TopN数、动态排除时间、分辨率等；
• 可选择DIA或PRM模式用于目标磷酸肽定量验证。

 

2、磷酸化位点定位置信度低

（1）问题描述：

磷酸肽段可能含多个可修饰位点，难以准确定位特定残基。

 

（2）解决方案：

 

• 利用如Ascore、ptmRS等算法提高位点定位置信度；
• 控制FDR在严格阈值（如1%以下），结合手动审阅关键谱图；
• 增加重复采集次数，提高统计显著性。

 

四、生物学重复差异大，实验重现性差

1、问题描述：

不同批次或样本间磷酸化谱差异大，导致数据难以解释。

 

2、解决方案：

 

• 标准化样本处理流程，确保操作一致性；
• 引入内标肽段或使用TMT/iTRAQ等标记方法进行批间校正；
• 在设计上增加生物学重复，并采用统计方法评估差异可靠性。

 

五、数据生物学解读不足，影响研究深度

1、问题描述：

即使获得高质量磷酸化数据，也常因缺乏有效的生物学解读而“止步于表层”。

 

2、解决方案：

 

• 结合GO/KEGG等通路富集分析，发掘潜在调控网络；
• 利用Motif分析识别激酶底物关系，辅助筛选功能关键位点；
• 融合蛋白互作（PPI）网络及转录组数据，形成系统生物学图景。

 

磷酸化蛋白质组学是一项对实验细节要求极高的技术。只有从样本准备、富集策略、质谱优化到数据解读各环节都精雕细琢，才能捕捉到生物系统中那些微弱但关键的信号。如果您在磷酸化蛋白质组学研究中遇到技术瓶颈，欢迎联系百泰派克生物科技。我们致力于打造高灵敏度、高重现性的磷酸化组学解决方案，助力您精准揭示细胞信号网络中的动态调控机制。

 

 

 

百泰派克生物科技特色项目

 

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

 

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

 

 

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

 

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

 

 

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

 

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

 

 

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

 

 

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

 

 

百泰派克生物科技七大检测平台

 

 

 

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

4.七大质量控制检测平台，满足您一站式服务需求；

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6.致力于为您提供优质的生物质谱分析服务!