iTRAQ实验常见问题及解决方案

iTRAQ（Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation）广泛应用于定量蛋白组学研究，能够在同一次质谱分析中实现多达8或16个样本的相对定量，尤其适用于临床队列、疾病模型、药物作用机制等多样本比较的研究场景。然而，iTRAQ实验的高通量和高灵敏度也意味着其对实验设计、样品制备、数据分析等各环节提出了更高要求。在实际应用中，科研人员经常会遇到标记效率不足、样品损失、批次效应、定量偏倚等问题。

 

一、iTRAQ常见问题及成因分析

1、标记效率不足，信号强度低

（1）问题描述：部分肽段标记效率低于95%，影响定量准确性；质谱信号偏弱，无法可靠定量。

 

（2）可能原因：

① 蛋白酶解不完全，导致标记位点不足；

② 缓冲体系不适配，影响iTRAQ试剂与肽段结合；

③ 标记反应时间不足或试剂降解。

 

（3）解决方案：

① 确保酶解充分，可优化酶:蛋白比例和酶解时间；

② 使用推荐的无胺缓冲体系（如TEAB），避免干扰标记反应；

③ 现配现用iTRAQ试剂，并确保反应≥2小时，常温避光操作。

 

2、蛋白回收率低，样品损失严重

（1）问题描述：标记前后蛋白/肽段浓度显著下降，质谱上机样本不足。

 

（2）可能原因：

① 蛋白抽提过程有沉淀或吸附；

② yǐjīng沉淀或固相萃取过程操作不当；

③ 真空干燥时间过长，导致肽段变性或氧化。

 

（3）解决方案：

① 优化裂解液配方，增强蛋白溶解力（含有适量SDS、尿素、蛋白酶抑制剂等）；

② 固相萃取过程控制pH和洗脱条件，避免过度洗脱；

③ 使用SpeedVac干燥，控制在适当时间内完成。

 

3、同位素污染或信道串扰（Reporter Ion Crosstalk）

（1）问题描述：定量信号存在串扰，导致不同通道的差异被掩盖。

 

（2）可能原因：

① iTRAQ标签的同位素纯度不足；

② 数据处理未进行串扰修正；

③ 仪器分辨率设置不当。

 

（3）解决方案：

① 选择高纯度iTRAQ试剂（如AB Sciex原装）；

② 在数据分析中启用串扰修正算法（e.g., isotopic correction matrix）；

③ 提高质谱MS2分辨率，增强reporter ion分辨能力。

 

4、批次效应干扰样本比较

（1）问题描述：技术重复一致性差，样本间差异可能源于批次间变化。

 

（2）可能原因：

① 不同批次样本处理和上机时间不一致；

② 酶解或标记操作人为误差大；

③ 质谱仪运行状态波动。

 

（3）解决方案：

① 同一实验尽可能安排在一次iTRAQ标记和质谱检测内完成；

② 引入内参蛋白或标准肽进行跨批次归一化；

③ 对质谱仪状态进行系统校准与监测。

 

二、数据分析中常见问题

1、鉴定率低，蛋白定量信息不足

（1）可能原因：

① 肽段覆盖度低，数据库匹配失败；

② 信噪比不佳，质谱数据质量不足；

③ 数据库选择不当或FDR设置过严。

 

（2）建议措施：

① 提升肽段质量，优化酶解与分离流程；

② 合理选择数据库版本并设定FDR阈值（通常≤1%）；

③ 采用MaxQuant、Proteome Discoverer等可靠分析软件。

 

2、差异蛋白筛选标准不明确

建议策略：

（1）设定Fold change（FC）阈值（如FC>1.5或<0.67）结合统计检验（p<0.05）；

（2）可视化表达模式（如火山图、热图、PCA）判断样本间变异是否显著；

（3）联合GO/KEGG富集分析筛选功能相关的关键蛋白。

 

iTRAQ作为一种成熟而高效的相对定量技术，仍在大规模蛋白质组学研究中发挥着重要作用。通过优化实验细节、提升样本处理标准化程度、结合高分辨率质谱平台和精准的数据分析，iTRAQ的定量能力将更趋可靠。百泰派克生物科技愿做您在蛋白质组研究中的得力助手，助力科学探索迈向更高维度。如需进一步了解iTRAQ实验的设计建议、报价或技术细节，欢迎访问百泰派克生物科技官网或直接联系我们的技术团队。

 

 

 

 

百泰派克生物科技特色项目

 

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

 

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

 

 

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

 

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

 

 

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

 

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

 

 

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

 

 

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

 

 

百泰派克生物科技七大检测平台

 

 

 

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

4.七大质量控制检测平台，满足您一站式服务需求；

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6.致力于为您提供优质的生物质谱分析服务!