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CV15-零背景TA克隆，不含多克隆酶切位点MCS

价格￥480

品牌艾德莱/aidlab
货号CV1501
产地国产
更新日期2025年12月16日

杭州昊鑫生物科技股份有限公司

10 年钻石会员

Zero Background pTOPO-TA Simple Cloning Kit（零背景 pTOPO-TA Simple 克隆试剂盒)

目录号：CV15

试剂盒组成、储存、稳定性：

试剂盒组成

组分	20/40 次 (CV1501)	80/160 次 (CV1502)
pTOPO-T Simple Vector(30 ng/μl)	20 μl	80 μl
1000bp Control (30 ng/μl)	5 μl	5 μl
10× Enhancer	20 μl	80 μl

▲ 本 TOPO 载体连接体系按照 10 μl 一次计算可以用 20 次，如果按照其它公司产品 5 μl 一次计算，使用次数可以增加一倍，20 次可用 40 次。

▲ -20℃储存，至少 12 个月。冰袋运输，1-2 天置于室外常温不影响质量。

产品介绍：

本制品和传统的 T4 连接酶原理不同，它利用了 Topoisomerase 可以在瞬间（几秒钟 - 几分钟）、高效（接近 100%）连接 DNA 片段的原理采用本公司独创的工艺制成。

可以在瞬间（几秒钟 - 几分钟）完成 A 末端 PCR 产物连接。
特制的新型载体质粒大小仅仅不到 2kb，充分发挥了 TOPO 载体越小，可容纳片段越大的优势，最大限度提高了大片段连接效率；连接后质粒大小比传统载体小 2kb 以上，质粒越小，转化效率越高，极大的提高了各种片段连接后的转化子数量。
采用氨苄抗性载体只需 0-10 分钟复苏时间，比卡那抗性载体 1 小时复苏时间缩短 6 倍。
最快可以省略 1 小时复苏步骤，热休克冰浴后，不用加 LB 复苏，直接将感受态涂板即可。从连接到涂板全程只需 15 分钟。
自杀基因零背景原理，无自连假阳性，无需繁琐蓝白斑筛选和菌落 PCR 筛选。大片段情况下随机挑一个克隆便是有插入的（接近 100%）。
连接部分能远远超越传统 TA 克隆载体，可连接长达 100 kb 片段（例如连接 5kb 片段，也可能达到挑 10 个菌落，至少 8 个是有插入的效果），是新一代世界领先的简单、快速、零背景免筛选的 TOPO Simple 载体。

本制品在克隆插入位点两侧不含多克隆酶切位点（Tample），需要时可在 PCR 扩增目的片段上先加入你的酶切位点。此时如果使用 PCR 扩增引物导入的酶切位点进行酶切时，酶切反应将不会受到载体上其它多克隆酶切位点影响，可大大提高酶切效率，增加亚克隆成功率。

注意：测序只能采用 M13F/M13R 通用引物测序（见后面图谱），但是不能采用 M13-(47)/M13-(48) 通用引物测序。

操作步骤：

1. 连接反应的准备：

PCR 引物使用正常设计的引物即可，不需做任何改变（不能用磷酸化引物）。使用能在 PCR 产物末端加一个突出的 3'-A 的酶系扩增（如 Taq、LA Taq、F8 Mix、Taq Mix）。PCR 产物一般建议回收纯化（如货号 DR01），这样可以避免后续可能的问题。如果 PCR 产物仅有目的条带、无非特异条带和引物二聚体，也可尝试直接进行连接反应。如果是以质粒为模板的 PCR 产物则最好进行纯化，因为模板质粒也可能长出菌落（但不是想构建的目的载体）。

2. 连接反应：

室温设立 10 μl 连接体系（建议用 0.2 ml PCR 管，PCR 仪器控温）：

试剂	规格
纯化后的 PCR 产物或者 1 μl 1000 bp Control	0.5-5 μl
pTOPO-TA Simple Vector	1 μl
10× Enhancer	1 μl
灭菌水	X μl
总体积	10 μl

加完试剂后，用移液器轻轻吹打混匀或者轻弹管底混匀，低速瞬时离心收集所有液体在离心管底，注意此步骤不能在冰上进行，只能在室温（25℃-37℃）进行。

▲ 如果使用 5 μl 体系连接，各成分按照比例减半使用，使用次数可以加倍。

不同大小插入片段的推荐用量（注意过量太多了，反而导致转化子减少）：

插入片段大小（bp）	推荐用量（ng）
100-1000	10-40
1000-2000	40-80
2000-5000	80-180

37℃连接 5 分钟（建议置 PCR 仪器上控温）。

▲ 本载体推荐室温（25℃-37℃）5 分钟完成连接。长片段或者连接困难片段可以延长连接时间到 10-15 分钟，温度可选 37℃，可显著增加转化子数量。
连接产物置于冰上备用。立即接标准的感受态转化步骤或快速转化步骤。

3. 快速转化：

感受态细胞从 - 80℃拿出，迅速插入冰浴中，解冻融化（约 1-3 分钟左右）。
立刻加入 5 μl 连接液 (最多可 10 μl 连接液全加入，只要体积不超过感受态细胞体积的 1/10), 手指拨打 (Flick) 离心管底轻轻混匀 (避免用枪吸打)，冰浴放置 5 分钟。
热休克：42℃水浴热休克 60 秒，迅速放回冰浴静置 2-3 分钟，该过程不要摇动离心管。

▲ 本公司技术连接效率比竞争对手高 10-100 倍，所以如果后续发现转化子很多，甚至长满板子，做完热休克步骤后，可以省略步骤 4（复苏），直接将热休克冰浴后的感受态细胞涂板，培养过夜即可。这样从连接到涂板全过程仅需要 15 分钟，超快速超便捷的简化了操作步骤，缩短了时间。
复苏 (可选步骤)：加 500 μl LB 或者 SOC 培养基 (不含抗生素),37℃200 rpm 振荡培养 10-20 分钟。

▲ 根据我们的经验，一般可以直接将培养基（如从冰箱取出温度低，应事先置 37℃温箱回温至 22-37℃）加入到感受态细胞的 1.5 ml 离心管，盖上离心管盖，水平固定在振荡培养箱中振荡培养复苏即可，不需要转移到试管培养复苏。

▲ 一般商品化的感受态细胞不超过 2 kb 插入片段情况下，热休克后 10-15 分钟复苏可以得到足够多转化子，可以提高实验室空间的感受态效率、或者转化子少、插入片段长的情况下可以提高使用时间到 30-60 分钟以得到更多的转化子。

▲ 本公司技术连接效率比竞争对手高 10-100 倍，追求最简单最快速的用户可以尝试省略步骤 4（复苏），直接将热休克冰浴后的感受态细胞涂板，培养过夜即可。热休克步骤进行后，后续这样操作从连接到涂板全过程仅需要 15 分钟，超快速流程极大的简化了操作，缩短了时间。
取 100-200 μl 菌液涂板 (培养板含氨benzylpenicillin 100 μg/ml)，培养过夜。

4. 转化子的筛选鉴定：

本制品采用自杀基因背景原理，无插入自连的细菌会自杀无法生长，因此几乎没有假阳性，一般情况下，可以达到所见即所得，只要是长出来的菌落正常（不是污染的杂菌，转化子数量也不算太少），基本就 100% 包含插入。因此插入片段不超过 2-3kb 的情况下强烈建议不做菌落 PCR 鉴定，直接挑 1-2 个去测序。

一般本公司 TOPO 载体阳性率非常高，所以菌落生长正常，数量也不是太少的情况下建议直接去测序（强烈建议不做菌落 PCR 筛选）。注意测序引物不能采用 M13-(47)/M13-(48) 通用引物测序。
TOPO 载体的菌落 PCR 结果容易出现假阴性（就是菌 P 失败显示没有插入或者扩大小小不对，实际却是有插入的）。因此在使用菌 P 鉴定的情况下，如菌 P 结果阴性，一般不可相信此结果。如果是菌 P 结果，或者显示扩增出大小和预期不符合，一般可以相信，要考虑结果是假阴性的可能，需要直接去测序鉴定，测序成功的完成实验；测序不成功的可以进一步提取质粒跑电泳看大小，或者酶切鉴定来确认。
用上述培养的白色菌落的菌液提出质粒，插入片段较大的情况下，直接跑电泳看质粒大小就直接能鉴定是否插入的质粒，还可用载体骨架上酶切位点如 ApaI/BglI/BsaHI，或者插入片段上引入的酶切位点酶切鉴定，或者琼脂糖凝胶电泳检查片段大小，确定是否含有目的片段。

CV15-零背景TA克隆，不含多克隆酶切位点MCS

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文献和实验

该产品被引用文献

1. Detection and genetic diversity analysis of Prunus necrotic ringspot virus in West Liaoning. ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA 2017, 4Y(1):15-25

2. A 23-Nucleotide Deletion in STK11 Gene Causes Peutz–Jeghers Syndrome and Malignancy in a Chinese Patient Without a Positive Family History. Digestive Diseases and Sciences 2017, 62(11): 3014–3020

3. A novel mutation (c.855delG) in STK11 gene is associated with Peutz–Jeghers syndrome in a Chinese family. Digestive and Liver Disease 2018, 50(3) DOI: 10.1016/j.dld.2017.12.007

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