Olink 实验失败常见原因及解决方案

在Olink基于PEA（Proximity Extension Assay）技术的蛋白组学研究中，科研人员可以用极少的样本量（1-3 μL血浆/血清）获得上千种蛋白的表达谱。然而，实验并非总能顺利完成，低检测率、重复性差或结果偏差等问题可能导致数据无法使用或结论失真。本文将总结Olink实验中常见的失败原因，并提供实用的解决方案，帮助科研人员优化项目流程，提升数据质量。

 

一、常见实验失败问题

1、检测率低或LOD（检测下限）比例过高

（1）大量目标蛋白的信号低于LOD，导致NPX数据缺失；

（2）部分面板中特定细胞因子或激素在样本中浓度过低，难以检测。

 

2、重复性差或批次间差异明显

（1） 相同样本在不同检测板上的NPX差异过大；

（2）批次间标准品或内参表现异常，影响跨批次可比性。

 

3、背景噪声高或非特异信号

（1）非特异性抗体结合导致背景升高；

（2）样本中存在干扰物（如脂质、溶血产物）影响探针配对效率。

 

4、样本不足或质量不合格

（1）血浆/血清体积不够或多次冻融导致降解；

（2） 溶血、脂血等状态影响检测灵敏度。

 

5、数据分析阶段问题

（1）未正确进行LOD处理或批次校正，导致统计结论偏差；

（2）忽略了NPX为相对定量，直接用于绝对浓度比较。

 

二、主要原因分析

1、样本相关因素

（1）采集和保存不规范（如室温放置过久、冻融次数过多）；

（2）溶血或高脂血增加背景干扰，降低检测率。

 

2、操作与技术因素

（1） 样本分组集中在同一板，导致批次效应显著；

（2） 反应体系被污染或操作误差造成扩增效率不均。

 

3、面板和目标蛋白选择问题

（1）选用的面板中部分蛋白在研究对象中本底浓度极低；

（2）未根据物种或疾病特点筛选合适的检测通路。

 

4、数据处理问题

（1） 未按Olink标准流程进行NPX标准化与LOD处理；

（2）未使用适当的统计方法（如FDR校正）筛选差异蛋白。

 

三、解决方案与优化建议

1、样本采集与质控优化

（1）使用EDTA血浆或血清，避免溶血与高脂干扰；

（2）采集后及时分离，-80℃保存，减少冻融次数；

（3）预先筛查样本质量，对异常样本进行剔除或特殊处理。

 

2、实验设计与操作改进

（1） 在检测板中随机分配不同分组样本，减少批次效应；

（2）使用标准QC样本（质控血浆）监控跨板一致性；

（3）严格执行Olink推荐的操作规范，避免污染或液体处理误差。

 

3、面板选择与方法组合

（1）在探索阶段结合Olink Explore HT（高通量）与特定免疫、炎症或肿瘤面板，提高检测效率；

（2）对低丰度或关键蛋白，使用靶向质谱或ELISA补充验证。

 

4、数据处理与分析标准化

（1）使用Olink官方推荐的NPX标准化流程；

（2）对LOD比例高的蛋白使用半LOD填补或剔除；

（3）应用R包limma、edgeR等进行批次校正与差异分析；

（4） 差异筛选应结合Fold Change（2^(ΔNPX)）和FDR校正，避免假阳性。

 

Olink蛋白组学平台以其高灵敏度和高通量优势，为生物标志物研究提供了强大的技术支持。但实验过程中可能出现的检测率低、重复性差或数据处理偏差，都可能影响研究结论。通过科学的样本管理、标准化的实验设计与数据分析，以及必要的多技术验证，科研人员可以显著降低失败风险。百泰派克生物科技凭借丰富的Olink项目经验和全流程支持能力，帮助科研团队高效解决技术问题，确保项目顺利推进并产出高质量成果。

 

 

 

百泰派克生物科技特色项目

 

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

 

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

 

 

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

 

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

 

 

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

 

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

 

 

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

 

 

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

 

 

百泰派克生物科技七大检测平台

 

 

 

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

4.七大质量控制检测平台，满足您一站式服务需求；

5.服务3000+企业，10000+客户的选择；

6.致力于为您提供优质的生物质谱分析服务!