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Western Blot技术服务,WB免疫印迹实验检测

Western Blot技术服务,WB免疫印迹实验检测
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供应商信息

上海信帆生物科技有限公司
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产品详情

地区: 上海
简介: 上海信帆生物提供Western Blot技术服务 WB免疫印迹,WB实验检测服务
提供商: 上海信帆生物
服务名称: Western Blot技术服务 WB免疫印迹服务
规格: 8个样本
Western Blot技术服务,WB免疫印迹实验检测

常规WB实验代测600元一张膜。

本司提供进口抗体费用:500元

本司提供内参费用:100元


免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(Western blotting),它是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性,现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白,并能对蛋白进行定性和半定量分析。
凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA-electrophoretic mobility shift assay)是一种研究DNA 结合蛋白和其相关的DNA 结合序列相互作用的技术,可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA 结合蛋白,目前已用于研究RNA 结合蛋白和特定的RNA 序列的相互作用。
Western blot 检测  1200元/膜 每张膜1--8样本,包含常规一抗及内参
EMSA    2800元/膜  每张膜1--8样本,包括探针及试剂

上海信帆实验服务项目:ELISA,免疫组化,免疫印迹Western Blot,放射免疫,实时荧光定量PCR,,免疫组织,特殊染色,病理学检测技术服务等等!我们拥有最好的实验室,客户检测项目均提供实验室仪器型号,提供操作详细步骤.欢迎联系!021-60528782
Western Blot实验
成功完成Western Blot检测,必须满足4个条件:

凝胶洗脱:转移期间蛋白质必须从凝胶中洗脱出来,如果蛋白质还截留在凝胶中,将无法在膜上进行分析

吸附到膜上:在转移过程中蛋白质必须吸附到膜上,如果蛋白不吸附,将无法在膜上进行分析

处理期间仍截留在膜上:在转移后的处理过程中蛋白质必须保持吸附在印迹膜上

处理过程中可接近:被吸附的蛋白质必须能够与检测试剂接触,如果蛋白质被掩盖则无法检测

成功进行WB检测,则设置合适正确的对照是必不可少的,只要正确设置了这些对照,即可快速和准确的找到WB的问题所在,并保证实验结果的准确性和特异性!一般需要设置的对照如下:

阳性对照:明确表达检测蛋白的组织或细胞,用于检测抗体的工作效率

阴性对照:明确不表达检测蛋白组织或细胞,用于检测抗体的特异性

二抗对照:不加一抗,用于检测二抗的特异性

内参对照:检测标本的质量和二抗系统

空白对照:不加一抗和二抗;用于检测膜的性质和封闭的效果 


Western Blot技术服务,WB免疫印迹实验检测

WB 检测基本过程 

1 、获取细胞或组织裂解物 

1)根据检测蛋白的位置选择合适的裂解buffer:

 
蛋白位置 
 
推荐buffer
 
全细胞
 
NP-40 or RIPA
 
胞浆(可溶性蛋白)
 
Tris-HCl
 
胞浆(骨架结合蛋白)
 
Tris-Triton
 
膜蛋白
 
NP-40 or RIPA
 
核蛋白
 
RIPA or 核蛋白提取试剂盒
 
线粒体蛋白
 
RIPA or 线粒体分离试剂盒
 
亦可购买商业化的蛋白提取试剂盒来保证标本制备的质量

2)选择合适的蛋白酶抑制剂,避免蛋白降解,从而保证检测的准确性!

2 、蛋白定量 

常用的蛋白定量方法:Bradford assay, Lowry assay 或BCA assay。定量后,可根据情况将标本保存在-20°C /-80°C备用,进行免疫沉淀(IP)或者直接进行电泳分离蛋白

3 、电泳分离蛋白质 

根据待测蛋白状态确定电泳条件: 

 
待测蛋白状态
 
凝胶条件
 
上样buffer
 
电泳buffer
 
Reduced - Denatured
 
还原,变性
 
含β-巯基乙醇或DTT,含SDS
 
含SDS
 
Reduced - Native
 
还原,不变性
 
含β-巯基乙醇或DTT,不含SDS
 
不含SDS
 
Oxidized - Denatured
 
不还原,变性
 
不含β-巯基乙醇或DTT,含SDS
 
含SDS
 
Oxidized - Native
 
不还原,不变性
 
不含β-巯基乙醇或DTT,不含SDS
 
不含SDS
 
根据待测蛋白分子量大小确定凝胶浓度
 
蛋白分子量(kDa)
 
凝胶浓度(%)
 
4-40
 
20
 
12-45
 
15
 
10-70
 
12.5
 
15-100
 
10
 
25-200
 
8
 
4 、转膜 

根据不同的检测目的和待测蛋白的特性,选择合适的膜类型。常用的转移膜类型有:PVDF膜、硝酸纤维素膜(NC膜)和尼龙膜,其中PVDF和NC膜的使用频率最高。各种膜的技术参数及比较如下:

 
 
 
PVDF膜
 
NC膜
 
尼龙膜
 
灵敏度和分辨率
 

 

 

 
背景
 

 

 
较高
 
蛋白结合能力
 
100-200ug/cm2(适用于SDS存在时与蛋白结合)
 
80-100ug/cm2
 
>400ug/cm2
 
机械强度
 

 
干的膜易脆
 
软而结实
 
溶剂抗性
 

 

 

 
使用前是否需要浸润
 
100%甲醛润湿
 
缓冲液润湿
 
缓冲液润湿
 
适用染色方法
 
胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁、考马斯亮兰
 
胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁
 
不能用阴离子染料
 
适用检测方法
 
显色法、化学发光、荧光、放射性、化学荧光、快速免疫检测
 
显色法、化学发光、荧光、放射性
 
显色、化学发光、放射性
 
适用范围
 
普通蛋白WB、糖蛋白检测、蛋白质测序、氨基酸分析、重复检测
 
普通蛋白WB、氨基酸分析、重复检测。0.1um膜适用于7kDa以下蛋白
 
低浓度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白、蛋白多糖、核酸检测常用
 
价格
 

 
较低
 

 
5 、封闭 

去掉膜上多余的非特异性结合位点,降低背景。常用的封闭溶液有:含BSA或者脱脂奶粉的TBST或TBS

6 、一抗孵育 

一抗的选择成功与否,是整个WB实验成功的关键:选择一抗有以下几个注意点:

选择适合检测标本种属的一抗(说明书有验证)

选择适用于WB实验方法的一抗(说明书有验证)

选择单克隆抗体或者经过亲和纯化的多克隆抗体

一抗的保存和使用:

根据说明书的要求条件进行抗体的保存;一般需要将抗体分装后放入-20度保存,绝对避免反复冻融。

抗体的工作液最好现配现用,在4度保存最好不要超过2周

根据说明书推荐浓度使用TBST稀释一抗。由于实验室条件和检测方法等的差异,说明书推荐的稀释比例只作参考,需要在说明书推荐的浓度周边进行多个浓度梯度的实验检测,然后选择信噪比最好的抗体浓度进行实验。如果说明书没有推荐浓度,可进行多个稀释比例进行摸索最佳稀释度(1:100-1:3000)。

孵育条件:推荐4°C孵育过夜(一般大于18个小时),根据抗体亲和力不同孵育时间有所区别

内参的选择和使用:WB 过程监测以及目的蛋白定量的标准! 

WB常用内参及其技术参数:

 
内参名称
 
分子量大小
 
适用范围
 
beta-actin
 
43kDa
 
胞浆和全细胞
 
GAPDH
 
30-40kDa
 
胞浆和全细胞
 
Tubulin
 
55kDa
 
胞浆和全细胞
 
VCDA1/Porin
 
31kDa
 
线粒体
 
COXIV
 
16kDa
 
线粒体
 
TBP
 
38kDa
 
细胞核
 
详情请参考

7 、二抗孵育 

根据说明书推荐浓度使用TBST稀释一抗。如果说明书没有推荐浓度,可进行多个稀释比例进行摸索最佳稀释度(1:1000-1:20000)。孵育条件一般为室温1-2小时

8 、底物孵育 

选择显色或者化学发光底物。一般倾向于化学发光,灵敏度高且背景低,节省抗体用量

9 、结果分析和检测 

凝胶成像系统检测或者暗室曝光到胶片

注意事项 
1、 抗体:事先咨询信帆生物,明确抗体种属及指标名称,确定我司抗体库否有该抗体可使用,如有一抗可免费提供,如无可由双方协商而定,客户自己购买提供或我公司代购;
2、 标本收集与保存: 
组织样品  新鲜组织放入液氮或-70度保存,组织不少于100mg(约绿豆大小); 
培养细胞  通过细胞计数取不少于100万个细胞于EP管,加入0.5ml生理盐水或蛋白保护剂,混匀后保存于冰箱(-70℃,避免反复冻融); 
血液细胞标本  以抗凝管保存血样或以淋巴细胞分离液分离细胞后加入0.5ml生理盐水或蛋白保护剂,保存(-70℃可长期保存,避免反复冻融) 
血清或细胞培养液标本  离心去掉杂质后取上清入EP管,保存(以上4℃可保存15-20天,-70℃可长期保存,避免反复冻融) 
3 、 样本运输:可选以下任何的一种方式寄送标本 
组织样本、细胞样本以干冰运输或加入蛋白保护剂后加冰袋运输; 
细胞样本也可以直接快件寄送培养瓶(密封保证不污染,培养液不漏出,细胞不要长得太满,50%左右,灌满培养液); 
血清或上清液直接加冰袋寄送(密封保证液体不漏出,视路途远近2-3天可到达)。 

流程:
1、客户告知实验分组、编号、检测样本类型、种属、指标,有具体要求请事先说明;
2、签订合同,寄送样本和抗体,如需我方提供抗体请事先说明;
3、客户支付预付款,进行实验。
4、提供原始数据,分析数据,实验室仪器型号,所用试剂品牌货号,图片,实验报告等! 


Western Blot技术服务,WB免疫印迹实验检测
 

 

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WB实验限时免费评估,免费设计实验方案,并完成实验。蛋白质免疫印迹(Western Blot )可以:(1)从蛋白质混合物中检出目标蛋白质;(2)定量或定性确定细胞或组织中蛋白质的表达情况;(3)用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用后续分析。    Western免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。    与Southern或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。    经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。   博舜联合医学实验中心是一所由复旦大学,华东师范大学,生命科学研究所,上海市调控生物学重点实验室,中国科学院上海药物研究所等同道精英共同打造的一站式医学实验服务平台。我们的顾问团队来自清华大学、复旦大学,交通大学,浙江大学、中山大学、华东师范大学、中国科学院上海药物研究所、德克萨斯农工大学、哈佛医学院、贝勒医学院等知名高校和研究机构的生命科学领域专家、学者组成。          主要致力于免疫学、分子生物学、病理、病理分子生物、代谢组学、生物化学技术在科研中的应用与推广,专业从事生命科学、药物领域及相关产品的引进、服务和研发。通过高度细分、全方位的服务平台,向广大客户提供医学科研样本检测、合作研究、开发及生产。     市场业务遍布国内外,目前服务过上海交通大学、复旦大学、浙江大学,中山大学,中山大学湘雅医学院,北京军事医学科学院,中国协和医科大学,上海生命科学研究所,中科院上海生化与细胞生物学研究所,瑞金医院,上海市第一人民医院,上海第九人民医院、中科院上海药物研究所、长海医院、瑞金医院等知名高校及科研机构。已发表的SCI文章和协助发表SCI文章,国家核心
蛋白免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。上海生博提供:包括SDS-PAGE垂直板电泳,转膜、杂交及显影拍照免疫印迹技术服务服务流程图Western blot正式实验实例 
 免疫印迹(western blot)技术服务◇样本制备1. 悬浮细胞:取大约1×107个细胞,低速离心收集,弃去培养液,加入1ml PBS悬浮细胞,转入小离心管中,低速离心沉淀细胞,弃去PBS,放入-70℃冰箱保存。2. 贴壁细胞:取大约1×107个贴壁细胞,胰酶消化后加入PBS悬浮细胞,转入小离心管中,低速离心沉淀细胞,弃去PBS,放入-70℃冰箱保存。3. 组织:采集新鲜组织(注意:生物体死亡后10分钟内取材料并保存好),组织块以PBS或生理盐水清洗干净,切为小块,放入-70℃冰箱中保存。样本量:组织样本,质量大于100mg;细胞样本,细胞数大于1×106;◇蛋白质抽提:实验对象为组织样品,取适量(250~500mg)新鲜组织样品或正确保存的组织样品,加1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂(或核蛋白抽提试剂),匀浆后抽提总蛋白(或核蛋白)。实验对象为细胞样品(细胞培养),每份样品取1×106~1×107细胞,PBS清洗细胞,去PBS加0.1ml~1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂(或核蛋白抽提试剂)抽提总蛋白(或核蛋白)。标本也可交给我们处理,组织标本每个10元,核蛋白或膜蛋白每个30元。◇收费标准:每张膜上做一种目的蛋白和相应的内参蛋白。每张膜上可以做8个样品。每张膜的费用是:1000元。一抗另计,抗体最好为进口单克隆抗体,我公司可代购,其它试剂免费。◇服务时限:收到样本和一抗之日起15-25个工作日提交实验结果。实时荧光定量Real Time PCR技术服务◇服务要求:1. 客户只需提供新鲜的标本。样本量:组织样本,质量≥100mg;细胞样本,细胞数≥1×107。或直接提供纯化好的DNA(大于5ug/样品)。2. 请通过E-mail 提供已知的全长基因序列。3. 请提供尽可能详细的背景资料:DNA/ RNA 来源、丰度等。◇样本制备及注意事项:1. 组织培养细胞:沉淀细胞,用PBS 洗一次,再用少量的PBS 悬浮细胞,然后加5~10 倍体积的RNAlater 。4℃过夜后,-20℃长期保存。2. 组织:采集新鲜组织(注意:生物体死亡后1分钟内取材料并保存好),快速简单切碎组织样品,任何一边的最大厚度不能大于0.5cm,然后将组织碎块放入到5 倍体积的RNAlater 中。4℃过夜后,-20℃长期保存。用RNAlat

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