宿主细胞蛋白抗体覆盖率分析

在生物药开发过程中，宿主细胞蛋白（Host Cell Proteins, HCPs）作为过程相关杂质，若残留于药品中可能引发免疫反应、干扰药效，甚至引起毒副作用。因此，全球药品监管机构（如FDA、EMA、NMPA）均要求在生物药生产过程中对宿主细胞蛋白抗体覆盖率进行监测与控制。目前，ELISA（酶联免疫吸附法）是行业公认的HCP常规检测手段。但ELISA的有效性高度依赖于抗-HCP多克隆抗体的识别范围。因此，抗体覆盖率分析（Coverage Analysis）成为ELISA方法学验证中不可或缺的一环。

 

一、宿主细胞蛋白抗体覆盖率分析的核心意义

1、保障HCP ELISA方法的可靠性

（1）ELISA只能检测被抗体识别到的HCP种类

（2）若覆盖率低，可能存在大量“盲区蛋白”，导致风险评估失真

 

2、满足监管法规要求

（1）ICH Q6B、FDA/EMA技术指导文件均建议进行抗体覆盖率验证

（2）部分国家的生物制药注册资料中已将该分析列为必交内容

 

3、评估抗体与样品适配性

（1）不同细胞系、工艺阶段产生的HCP种类差异大

（2）覆盖率分析可判断现有抗体是否适用于特定产品体系

 

二、常用宿主细胞蛋白抗体覆盖率分析技术

1、二维Western印迹法（2D-WB）

（1）原理：将HCP样品进行等电聚焦+SDS-PAGE双向分离，转膜后用抗体检测识别点

（2）通过与Coomassie或银染图谱比对，统计抗体识别的蛋白点数量，计算覆盖率

（3）Coverage =（抗体识别蛋白点数 / 总蛋白点数）× 100%

 

2、免疫亲和质谱法（Immunoaffinity-MS）

（1）将抗体共价偶联至磁珠，富集其可识别的HCP

（2）通过质谱识别结合蛋白的种类，实现蛋白质层面的覆盖率分析

（3）优势：能确认每个被识别蛋白的身份，适合高要求项目

 

3、差异蛋白染色法（2D-DIGE）

（1）将两份样本分别标记不同荧光染料（总HCP与被抗体识别部分）

（2）通过2D电泳图像重叠，直接比较识别差异区域

（3）常作为2D-WB的可视化补充方法

 

4、间接评估法：ELISA响应比对

（1）对多个不同来源HCP样本进行ELISA检测

（2）若响应偏低，提示可能存在覆盖率不足问题

（3）缺点：无法明确缺失蛋白种类，无法定量覆盖比例

 

三、宿主细胞蛋白抗体覆盖率分析：二维Western印迹法分析流程详解

1、样本准备

（1）选取表达系统代表性HCP样品：细胞裂解液或中期发酵液

（2）蛋白含量控制在1–2 mg/mL，确保蛋白点丰富、图谱可分析

 

2、二维电泳

（1）第一维：等电聚焦（pI分离），建议使用pH 3–10 或 pH 4–7 IPG胶条

（2）第二维：SDS-PAGE，按分子量分离蛋白条带

 

3、转膜与显色

（1）转膜至PVDF膜后分为两张：一张Coomassie染色，一张Western显色

（2）抗体反应后使用HRP或化学发光法显影

 

4、图像对比与数据分析

（1）通过图像分析软件比对蛋白点位置与数量

（2）计算识别点数量并估算抗体覆盖率，通常建议 ≥70%为合格

（3）若覆盖率偏低，可考虑更换免疫原或混合多抗策略

 

四、影响宿主细胞蛋白抗体覆盖率分析的关键因素

1、免疫原的选择

（1）使用“晚期收获物”或与工艺相关的真实HCP更具代表性

（2）若仅使用早期细胞裂解物，可能忽略后期表达的关键杂质蛋白

 

2、抗体免疫策略

（1）使用多批次免疫、多动物来源可提高多样性

（2）可联合免疫不同工艺条件下的HCP样本，提高泛识别能力

 

3、抗体纯化方式

（1）过度纯化可能损失部分识别亚群

（2）建议保留IgG多样性，避免“亲和选择偏倚”

 

4、检测系统与图谱分析能力

（1）电泳系统分辨率越高，蛋白点分离越清晰

（2）图像分析人员经验与软件参数设置会直接影响点数统计准确性

 

抗体覆盖率是HCP ELISA方法的灵魂所在。只有科学地验证抗体识别能力，才能确保HCP检测结果真正反映产品风险。在CMC申报、后期批次一致性验证以及跨工艺线平台转移中，覆盖率分析都是质量控制的重要组成部分。百泰派克生物科技愿作为您可靠的HCP检测合作伙伴，从抗体开发、覆盖率验证到定制ELISA开发，提供专业、高效、合规的技术服务，助力生物药产品质量管理再上台阶。

 

 

 

百泰派克生物科技特色项目

 

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

 

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

 

 

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

 

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

 

 

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

 

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

 

 

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

 

 

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

 

 

百泰派克生物科技七大检测平台

 

 

 

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

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