宿主细胞蛋白（HCP）抗体覆盖率分析

宿主细胞蛋白（Host Cell Proteins, HCPs）是生物药生产过程中源于表达系统的杂质蛋白。这些残留蛋白即使在极低水平，也可能引发免疫原性、稳定性降低或干扰药效，因此各国药典与法规均要求对其进行严格监测。HCP检测的主流方法是基于多克隆抗体的ELISA（酶联免疫吸附）。但ELISA的准确性取决于其抗体对目标宿主系统中HCP的识别能力，即所谓抗体覆盖率（Antibody Coverage）。如何科学验证抗体识别范围，成为生物制药质量研究不可或缺的一部分。

 

一、抗体覆盖率的定义与重要性

1、宿主细胞蛋白（HCP）抗体覆盖率定义

（1）抗体覆盖率含义：抗-HCP抗体能识别的蛋白种类在所有HCP中的占比

（2）常用计算公式：

覆盖率 (%) = 抗体识别的HCP蛋白点数 / 总HCP蛋白点数 × 100%

 

2、宿主细胞蛋白（HCP）覆盖率验证的意义

（1）确保ELISA检测具备真实代表性，避免“检测盲区”

（2）提升方法学的可重复性和可比性，满足申报与审评要求

（3）监管合规性要求（如ICH Q6B、FDA/EMA指南均明确提出抗体覆盖率验证义务）

 

3、宿主细胞蛋白（HCP）实际应用价值

（1）用于商业通用抗体评估（如CHO HCP抗体是否适合某产品）

（2）用于新建或定制ELISA方法验证

（3）用于抗体免疫原策略优化（提高识别范围）

 

二、常见的HCP抗体覆盖率分析方法

1、二维Western印迹法（2D-Western Blot）：国际认可金标准

（1）原理：通过二维电泳分离HCP蛋白后，用待验证抗体检测其识别点位

（2）对比Coomassie染色图谱与Western图谱，计算识别蛋白点数与覆盖率

（3）覆盖率 ≥70% 一般认为满足CMC申报需求

 

2、免疫亲和质谱法（IA-MS）：识别种类最精准

（1）原理：用抗体富集被识别蛋白后，借助LC-MS/MS分析其真实种类

（2）优势：可提供蛋白级别识别结果，适合补充验证或高风险产品

（3）挑战：周期长，成本高，对MS平台要求高

 

3、2D-DIGE法（双荧光差异电泳）

（1）原理：将总HCP与抗体识别HCP分别荧光标记，合并二维电泳后比较差异区域

（2）可作为二维Western印迹的补充手段，提高可视化效果

（3）不具备蛋白识别能力，需联用MS确认

 

三、二维Western印迹法验证流程详解

1、实验准备阶段

（1）样品来源选择：建议使用中期或终产阶段的HCP样品，代表性强

（2）浓度控制在1–2 mg/mL，确保图谱清晰

（3）建议选用pH 3–10 或窄梯度IPG胶条做第一维分离，分辨率更高

 

2、电泳与转膜步骤

（1）第一维等电聚焦分离蛋白pI差异

（2）第二维SDS-PAGE按分子量进一步分离

（3）湿转至PVDF膜，分别进行Coomassie染色与Western显影

 

3、图谱分析与结果统计

（1）用图像分析软件比对蛋白点位置，统计总点数与识别点数

（2）建议联合人工审阅，排除背景/伪点干扰

（3）输出：

  - Western印迹图谱

  - 染色图谱

  - 点位覆盖率计算表格

  - 点位分布热图（可选）

 

四、影响宿主细胞蛋白（HCP）覆盖率分析的关键因素

1、免疫原的多样性与代表性

（1）建议采用终产工艺样本、不同时间点混合样本等策略

（2）若仅用细胞裂解液，易漏检分泌型或表达后期蛋白

 

2、抗体的多样性与亲和力

（1）多动物免疫可增加识别谱宽度

（2） 抗体过度亲和纯化可能去除低亲和亚群，影响覆盖面

 

3、蛋白分离与图像分析系统

（1） 电泳分辨率决定蛋白点识别能力

（2）图像比对依赖软件算法与人工经验，主观误差需控制

 

在生物药质量控制体系中，HCP检测是不可或缺的关键环节。而抗体覆盖率作为ELISA方法的“灵魂指标”，直接关系到检测结果的准确性、完整性与可申报性。百泰派克生物科技将继续深耕抗体验证平台，为生物药企业提供标准化、高合规、可定制的HCP抗体覆盖率分析服务，助力您的CMC研究加速高质量推进。

 

 

 

百泰派克生物科技特色项目

 

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

 

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

 

 

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

 

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

 

 

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

 

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

 

 

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

 

 

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

 

 

百泰派克生物科技七大检测平台

 

 

 

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

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