小鼠胰腺星状细胞分离试剂盒

产品描述

小鼠胰腺星状细胞(PSC)通过胶原酶消化法从胰腺组织中分离获得。胰腺由外分泌腺(腺泡和腺管，分泌消化酶)和内分泌腺(胰岛细胞，调控血糖)组成。PSC是胰腺纤维化的主要效应细胞，具有静息态和激活态两种状态：静息态PSC：胞内含维A脂滴(油红O染色红色)，表达Desmin蛋白。激活态PSC：脂滴减少，表达α-SMA，促进胶原沉积。原代培养6天仍可见脂滴，传代后脂滴消失。接种24小时内表达Desmin，48小时后转为表达α-SMA，传代后完全激活。本试剂盒采用消化法，使用本试剂盒提取所得的小鼠胰腺星状细胞纯度>90.0%，后续可直接进行RT-qPCR、Western blot等基本生物学实验。

适用范围

该试剂盒适用于不同型号小鼠胰腺星状细胞的分离，规格为10T，1T可供1只小鼠使用。

运输和存储条件

2-8 ℃保存与运输，保质期为参考下表。所有组分开封后，有效期为 6-8 周，建议尽快使用。

配套培养基信息

表1. 试剂盒组成信息

产品名称	产品规格	储存条件
小鼠胰腺星状细胞消化液	100 mL	2-8°C 3 个月
小鼠胰腺星状细胞消化终止液	250 mL	2-8°C 3 个月
小鼠胰腺星状细胞专用培养基	250 mL	2-8°C 3 个月
小鼠组织处理缓冲液	500 mL	2-8°C 6 个月

 

分离步骤

一、小鼠胰腺星状细胞分离及培养

实验前准备：分装所需小鼠胰腺星状细胞消化液、小鼠组织处理缓冲液、小鼠胰腺星状细胞专用培养基;实验需自备手术器械、70μm细胞筛、培养皿、巴氏管若干、离心管若干。

1. 将小鼠麻醉后，用酒精喷洒大小鼠全身进行消毒，放在培养皿里面，喷洒培养皿放入生物安全柜。

2. 将小鼠固定，用两把消毒眼科剪依次剪开小鼠皮层、肌层，上至剑突，下至耻骨联合，左右至两侧腋中线，再将皮瓣外翻、固定，打开腹腔充分暴露内脏，然后用眼科镊将小肠翻向左侧，提起胃，暴露胰腺，用眼科剪及镊子小心将其游离，迅速取出放入盛有预冷(4℃)小鼠组织处理缓冲液的培养皿中。

3. 在培养皿中仔细剔除胰腺周围的被膜结缔组织，用眼科剪将其粗剪成小块后。

4. 再把组织块置于培养皿中，用预冷的小鼠组织处理缓冲液漂洗3次以去掉表面血污，然后用滴管吸净小鼠组织处理缓冲液，换用眼科剪再次反复剪切胰腺组织至0.5mm×0.5mm×0.5mm大小为止(组织糜)。

5. 加入预热(37℃)的小鼠胰腺星状细胞消化液10ml。

6. 用无菌巴氏吸管(或大口径移液管)轻柔吹打混匀，将含有组织糜的消化液混合物全部转移至一个50mL无菌离心管中。

7. 将离心管置于37°C恒温水浴摇床中，以低速(60~80rpm)振荡消化20分钟。

8. 消化20分钟结束后，立即加入预冷的(或室温)小鼠胰腺星状细胞消化终止液25mL，用无菌巴氏吸管或10mL移液管，反复轻柔吹打消化混合物数十次(约30-50次)。

9. 将吹打后的细胞悬液通过一个无菌的70μm孔径细胞筛网过滤至一个新的50mL无菌离心管中。用少量终止液或基础培养基冲洗原离心管壁和筛网，确保所有细胞被收集。

10. 500 xg离心5 min后，弃上清，用小鼠胰腺星状细胞专用培养基重悬细胞后计数，即可进行铺板培养，铺板密度见表2。

表2. 小鼠胰腺星状细胞推荐铺板密度

培养器皿	细胞量（×104个）
10cm培养皿	300
6cm培养皿	150
6孔板	60
12孔板	20
24孔板	10

 

注意事项

1. 组织分离操作建议在冰上操作，组织处理缓冲液建议预冷处理。

2. 分离时应避免过度消化、过度重悬等操作导致细胞损伤。

3. 细胞专用消化液、培养基中含有微生物生长所需的营养成分，请在超净工作台内打开，按照所需要量分装，并且用封口膜封住瓶口，即取即用，以避免污染。