羊魏氏梭菌（CW）核酸检测试剂盒（探针法荧光PCR）

羊魏氏梭菌（CW）核酸检测试剂盒（探针法荧光PCR）
英文名称：Diagnostic Kit for sheep Clostridium Welchii
羊魏氏梭菌病又可被称为羊产气荚膜杆菌病，主要是由于感染魏氏梭菌而引发的一种急性中毒性的传染   性疫病，魏氏梭菌具有多种血清型，对羊群致病的主要有 B 型、C 型和 D 型 3 种，在临床上分别引起羔羊痢疾、羊猝疽以及羊肠毒血症等病症，健康羊感染后发病突然，病程发展非常快，通常来不及医治就会死亡，   发病率和死亡率均比较高，严重影响羊只的健康发育，给羊养殖业带来了较为严重的危害。 本试剂盒适用于检测水样粪便，疑似污染的水、食物等样本中的魏氏梭菌，用于魏氏梭菌感染的辅助诊   断，其检测结果仅供参考。

本试剂盒用一对魏氏梭菌的特异性引物，结合一条特异性探针，用荧光 PCR 技术对魏氏梭菌的 DNA 进行体外扩增检测，用于对可疑感染病料的病原学检测。

羊魏氏梭菌（CW）核酸检测试剂盒（探针法荧光PCR）试剂组成：

包装规格	25T/盒	50T/盒
CW 反应液	500μL×1 管	500μL×2 管
酶液	25μL×1 管	50μL×1 管
CW 阳性质控品	250μL ×1 管	250μL ×1 管
阴性质控品	250μL ×1 管	250μL ×1 管

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用

储存条件及有效期：-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。

适用仪器：ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

标本采集：水样便取 0.5~1mL；疑似污染的食物取 1g。

保存和运输：采集或处理好的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24 h；若需长期保存，应放置-70℃以下保存，冻融不超过 3 次。

使用方法：
1.    样品处理（样本处理区） 1.1    样本前处理 水样便 8000rpm 离心 2min，取上清液 100ul 于 1.5mL 灭菌离心管中；疑似污染的食物用手术剪剪碎混匀后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中，8000rpm 离心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中；疑似污染的水直接取 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中。 1.2    核酸提取 推荐采用公司生产的核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取，   请按照试剂说明书进行操作。 2.    试剂配制（试剂准备区） 根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N（N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；反应管数每满 10 份，多配制 1 份），每测试反应体系配制如下表： 试剂    CW 反应液    酶液 用量（样本数为 N）    19μL    1μL 将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，20μL/管。 3.    加样（样本处理区） 将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀， 短暂离心。 4.    PCR 扩增（核酸扩增区）   4.1    将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内； 4.2    设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL； 荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择 None 即可。 4.3    推荐循环参数设置： 步骤    循环数    温度    时间    收集荧光信号 1    1 cycle    95℃    2min    否 2    45 cycles    95℃    15sec    否         60℃    30sec    是 5.    结果分析判定 5.1    结果分析条件设定（请参照各仪器使用说明书进行设置，以分析 ABI7500 仪器为例） 反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用户可根据实际情况自行调整，Start 值可设在 3～15、End 值可设在 5～20，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击 Analyze 自动获得分析结果。 5.2    结果判断 阳性：检测通道 Ct 值≤40，且曲线有明显的指数增长曲线； 阴性：样本检测结果无 Ct 值，且无特异性扩增曲线； 可疑：样本检测结果 40＜Ct 值≤45，建议重复检测，如果检测通道仍为 40
注意事项
1.    所有操作严格按照说明书进行；
2.    试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
3.    反应液应避光保存；
4.    反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
5.    使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
6.    样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
7.    实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
8.    试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

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