猪化脓隐秘杆菌(Tp)核酸检测试剂盒（探针法荧光PCR）

猪化脓隐秘杆菌(Tp)核酸检测试剂盒（探针法荧光PCR）
英文名称：Porine Trueperella pyogenes Detection Kit
化脓隐秘杆菌是一种重要的条件性致病菌，能引起猪，牛，羊等多种动物及人类多组织化脓性感染，给畜牧业发展带来严重影响。本试剂盒适用于检测疑似畜样的脓包，生殖道口或乳房等标本中化脓隐秘杆菌 DNA， 适用于猪化脓隐秘杆菌感染的辅助诊断。

本试剂盒用对化脓隐秘杆菌基因保守区设计特异性引物和探针，用一步法荧光 RT-PCR 技术对猪化脓隐秘杆菌 DNA 进行体外扩增检测，用于对可疑感染品的病原学检测。

猪化脓隐秘杆菌(Tp)核酸检测试剂盒（探针法荧光PCR）试剂组成：

包装规格	25T/盒	50T/盒
Tp 反应液	500μL×1 管	500μL×2 管
酶液	25μL×1 管	50μL×1 管
Tp 阳性质控品	50μL ×1 管	50μL ×1 管
阴性质控品	250μL ×1 管	250μL ×1 管

注：1）不同批号试剂不能混用；2）试剂盒内各试剂组份足够包装规格所标示的检测次数。

储存条件及有效期：-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。

适用仪器：ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

标本采集：发病畜样品采集：采样前将家畜固定，用毛刷刷去其身体和乳区粘附污物，用温水擦净脓包、生殖道口或乳房，再用消毒液和 75%酒精充分消毒取样部位。 脓汁采集：无菌注射器缓慢抽出脓液，并注入无菌离心管中； 乳汁采集：人工挤乳，弃去头 3 股乳汁，第 4 股乳汁用无菌的离心管收集； 阴道分泌物采集：将套有无菌管套的输精枪插入子宫体，然后将输精枪抽出，用 10mL 无菌注射器对准管套口将子宫粘液吸出。 死亡畜样采集：无菌采集病变的肺脏、脾脏、淋巴结等小块组织迅速放入无菌袋中；胸腔积液、关节液和脓汁等液体样品放入无菌离心管中。

保存和运输：上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置于-70℃，但不建议超过 6 个月，标本运送应采用 2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。

使用方法：
1.    样品处理（样本处理区）
1.1    样本前处理 组织样品剪碎后，加入无菌的终浓度为 50%甘油的生理盐水充分匀浆后立即进行核酸提取或者短期内保存于-20℃，长期保存置于-70℃；液体样品以 1：1 的体积比加入无菌的 50%甘油的生理盐水，充分混匀后，可立即进行核酸提取。短期内可保存于-20℃，长期保存可置于-70℃。
1.2    核酸提取 推荐采用公司生产的核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取， 请按照试剂说明书进行操作。
2.    试剂配制（试剂准备区） 根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N（N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；反应管数每满 10 份，多配制 1 份），每测试反应体系配制如下表： 试剂    Tp 反应液    酶液 用量    19μL    1μL 将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，20μL/管。
3.    加样（样本处理区）   将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀， 短暂离心。
4.    PCR 扩增（核酸扩增区）
4.1    将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；
4.2    设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL； 荧光通道选择：检测通道（ReporterDye）FAM，淬灭通道（QuencherDye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择 None 即可。
4.3    推荐循环参数设置： 步骤    循环数    温度    时间    收集荧光信号 1    1 cycle    95℃    2min    否 2    45 cycles    95℃    15sec    否         60℃    30sec    是
5.    结果分析判定 5.1    结果分析条件设定 设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值（一般可在 3~15 范围内调节）、stop 值（一般可在 5~20 范围内调节），以及 Threshold 的 Value 值（上下拖动阈值线至高于阴性对照），重新分析结果。
5.2    结果判断 阳性：检测通道 Ct 值≤40，且有明显的指数扩增曲线； 阴性：样本检测结果 Ct 值>40 或无 Ct 值。
6.    质控标准 阴性质控品：无曲线或无 Ct 值显示； 阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。
7.    检测方法的局限性 1.    样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关； 2.    样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果； 3.    阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果； 4.    病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果； 5.    不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果； 6.    试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果； 7.    本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

注意事项
1.    所有操作严格按照说明书进行；
2.    试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
3.    反应液应避光保存；
4.    反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
5.    使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
6.    样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
7.    实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
8.    试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

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