53BAB001 诺博莱德甘氨酸羟甲基转移酶活性测定试剂盒

甘氨酸羟甲基转移酶活性测定试剂盒

SHMT Assay Kit

目录号：53BAB001

规格：100T

保存：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

产品简介:

本产品用于测定甘氨酸羟甲基转移酶（GlycineHydroxymethyltransferase，SHMT，EC2.1.2.1）活性。其原理是该酶可以催化特异反应，其中一个底物在279nm处有特征光吸收，故以之为测定物，它在该波长下的光吸收变化速度可反映其在反应中的转换速度，由此可测定SHMT活性。本产品具有如下特点：

1.即开即用，使用便捷，用户不需要优化条件，只需准备待测样本。

2.最低检测限为0.1U，线性范围在0.2-10U之间。

3.本试剂盒1个酶活性单位的定义是在最适反应条件下，让测定物每分钟产生1μmol变化所需的酶量。注意：同一EC号下面的各种酶可能有不同的最适反应条件，本产品是基于大肠杆菌SHMT的最适反应条件开发。如果用户所测酶的最适反应条件与之不同，可联系本公司定做。

4.本产品足够100次1mL体系的比色皿检测或400次250μL体系的96孔板检测。

5.本产品的起始材料是制备好的待测样本。本试剂盒不包括样本制备试剂，如果有需要可联系本公司另购。

6.基于连续测定法，提供标准曲线法和消光系数法两种操作流程。

7.本产品只可用于科研。（售前手册仅供参考，具体实验方案以出货手册为准。）

产品组成：

使用方法（仅供参考）：

一、首次使用本试剂盒时需要制备下列溶液。以下除试剂盒成份外，SHMT简称为酶。

1. 含底物的酶反应液：转移10mL SHMT反应液到一新的试剂瓶中作为预留待用，然后将所有SHMT底物干粉加入到剩下的100mL SHMT反应液中，颠倒摇晃20次，得100mL含底物的酶反应液。

2. 酶阳性对照：将110μL试剂盒提供的通用酶储存液加入到SHMT干粉管中，轻柔颠倒20次混匀，得酶阳性对照。注意：本试剂盒提供的阳性对照只够5次使用，故建议只在首次实验和在遇到问题需要分析原因时才使用。

3. 如果一次实验没有用完上述溶液，需将其放-20℃或更低温度保存。

二、制备待测样本

4. 用自选方式制备待测样本，记录下其总体积VmL便于后续计算酶比活性。待测样本的pH值最好在反应的最适pH附近，否则加入到反应中后可能会改变反应的pH；待测样本中也不得含有高浓度的、在279nm有光吸收的物质，不得含有能抑制SHMT活性的成份，也不得含有能提高或降低测定物浓度的无关酶。

5. 预留100μL待测样本（N个样中随机取一个），100℃水浴10分钟灭活其中的酶，放冰上待用。此为酶阴性对照。如果酶耐热，不能热灭活，则用制备待测样本时所用的抽提液替代。

6. 用自备试剂测定待测样本的蛋白浓度，以备后续计算酶比活时使用。

三、标曲制备

7. 下面以制备6个浓度梯度的标曲液和1个空白对照为例。标记0-6号共7个2mL离心管，并在0-5号管中加入1mL第1步预留的SHMT反应液，只6号管不加。

8. 在6号管中加入1mL试剂盒提供的1mM标曲液。

9. 在5号管中也加入1mL试剂盒提供的1mM标曲液，充分震荡1分钟。由于管中已经有1mL反应液，故得0.5mM标曲液。

10. 在4号管中加入1mL5号管中的标曲液，充分震荡1分钟，得0.25mM标曲液。

11. 在3号管中加入1mL4号管中的标曲液，充分震荡1分钟，得0.125mM标曲液

12. 重复上面的操作直到得到1号管的标曲液。0号管对照管不需要加入1号管的标曲液。最后所得0-6号管中标曲液浓度分别为0、31.3μM、62.5μM、125μM、250μM、0.5mM、1mM，各1mL，放37℃预热待用。

13. 将分光光度计开机预热30分钟，然后用超纯水调零。

14. 测定7个标曲液在279nm的光吸收（以下简称A值），每个样本测定三次。

15. 数据处理：计算1-6号每个样本的平均A值，然后用每个样本的A值减去0号空白对照的A值即得6个样本的真实A值。

16. 绘制标曲：以标曲液浓度（μM）为横轴，以A值为纵轴，绘制标准曲线并得到线性回归方程式A=aC+b，C为标曲液浓度，A为A值。

17. 此公式可在后续测试中反复使用，但在后续实验时必须设置1个质检点标曲液随待测样本一起测试。质控点标曲液的制备同上，其浓度必须在上步所得标曲的线性范围内，最好异于制备标曲所用的6个浓度。如果质控点的测试结果代入上步回归方程式得到的计算浓度跟其配制浓度相差在10%以内，则可将同组的待测样本A值代入公式直接计算其对应的C值。如果相差大于10%，则不能用此方程式，需同步制备新的标曲，得到新的回归方程式，再用其计算待测样本的C值。

四、样本测定

18. 按下表设置酶反应。酶阳性对照可以在首次实验或遇到问题需要查找原因时才使用。

19. 快速混匀30秒后放37℃并计时。如果仪器可以在线保温和自动连续测定，可以每1分钟采集1次A值共30分钟。如果仪器只能手动测定，则每5分钟测定1次A值，测定后在返回37℃继续保温。如此循环直到每个样本获得6个时间点的A值。

五、数据处理

20. 计算△A/min测定值：以时间为横轴，以A值为纵轴，绘制反应速率曲线，然后选择线性区域的△A/min为测定值。阴性对照也需要计算此值。

21. 计算△A/min真实值=待测样本△A/min测定值-阴性对照△A/min测定值。

22. 将上步所得ΔA/min真实值中的ΔA值导入到回归方程式A=aC+b中，求出在1mL反应体系中测定物每分钟的浓度变化值ΔC（μM）。

23. 由于酶反应体积为1mL，浓度单位为μM，故按1μM×1mL=0.001μmol的换算关系即可计算出ΔC对应的μmol数，用Nμmol表示。

24. 根据酶活性的定义（让测定物每分钟有1μmol变化量所需的酶量），故反应体系中的酶活性单位数为N。反应体积为1mL，故反应体系中酶浓度为N单位/1mL=N单位/mL。

25. 计算样本中的酶浓度：由于反应体系中的酶是待测样本中的酶稀释50倍而得（20μL样本加入到1mL反应系统中），故样本中酶的浓度=50*N单位/mL。试剂盒提供的酶阳性对照的浓度为1U/mL左右，如果通过测定得到的酶阳性对照的浓度跟此值相差过大，请跟本公司联系。

26. 计算样本的酶比活性：样本总体积（VmL，第4步）×酶浓度（50N单位/mL，上步）=样本总酶单位数（50NV）。样本总体积×蛋白浓度（第6步）=样本总蛋白量（单位一般转换成mg）。待测样本中的酶比活=50NV/总蛋白量（单位/mg）。

六、96孔板检测

27. 操作同上，只是在设置反应时，各成份的用量需要×25%；在计算时，需将1mL的反应体积改成0.25mL，需将1cm的光径改成所用96孔板的光径（需询问96孔板厂家）。

 

附：消光系数法

在大规模筛选时，如果知道测定物的消光系数，还可以选择更加快捷、不需要制备标曲的消光系数法测定酶活性。但由于得到测定物消光系数所用的缓冲体系跟本实际盒酶测定所用的反应体系不同，故结果可能有误差较。用户如果选择使用消光系数法，建议先用两种方法同时测定一个样本。如果结果差异大，则只能使用标曲法。如果差异可以接受，则可使用消光系数法。在操作上，两法的差异是从样本测定开始，故此处略去样本测定前的操作步骤。

七、消光系数法的样本测定

28. 按下表设置反应。酶阳性对照可以在首次实验或遇到问题需要查找原因时才使用。

29. 快速混匀30秒后放37℃并计时。如果仪器可以在线保温和自动连续测定，可以每1分钟采集1次A值共30分钟。如果仪器只能手动测定，则每5分钟测定1次A值，测定后在返回37℃继续保温。如此循环直到每个样本获得6个时间点的A值。

八、数据处理

30. 计算△A/min测定值：以时间为横轴，以A值为纵轴，绘制反应速率曲线，然后选择线性区域的△A/min为测定值。阴性对照也需要计算此值。

31. 计算△A/min真实值=待测样本△A/min测定值-阴性对照△A/min测定值。

32. 将△A换算成每分钟测定物浓度变化值：根据朗伯-比尔定律，A=εlC=消光系数*光径*浓度，故测定物浓度变化值△C=△A/εl。测定物消光系数ε=X/cm*M，比色皿光径为1cm，故测定物浓度变化值△C=△A/[（X/cm*M）*1cm]=（△AM/X）。由于M=mol/L，故△C=（△Amol/XL）=（△Ammol/XmL）=（△A*1000μmol/XmL）=1000△A/X（单位为μmol/mL）。

33. 酶反应体积为1mL，故在反应体系里测定物每分钟浓度变化值=△Cμmol/mL*1mL=△Cμmol=1000△A/Xμmol。

34. 根据酶活性的定义（让测定物每分钟有1μmol变化量所需的酶量），可知反应体系中酶单位数=1000△A/X。将本试剂盒所用测定物的消光系数为1400/cm*M，将此数代入上式即得具体数值。

35. 计算样本中的酶浓度：由于反应体系中的酶是待测样本中的酶稀释50倍而得（20μL样本加入到1mL反应系统中），故样本中酶的浓度=50*N单位/mL。试剂盒提供的酶阳性对照的浓度为1U/mL左右，如果通过测定得到的酶阳性对照的浓度跟此值相差过大，请跟本公司联系。

36. 计算样本的酶比活性：样本总体积（VmL，第4步）×酶浓度（50N单位/mL，上步）=样本总酶单位数（50NV）。样本总体积×蛋白浓度（第6步）=样本总蛋白量（单位一般转换成mg）。待测样本中的酶比活=50NV/总蛋白量（单位/mg）。

九、96孔板检测

37. 操作同上，只是在设置反应时，各成份的用量需要×25%。在计算时，需将1mL的反应体积改成0.25mL，需将1cm的光径改成所用96孔板的光径（需询问96孔板厂家）。

自备试剂:

待测样品，样本溶解液，超纯水，蛋白浓度测定试剂盒，比色皿及与之匹配的分光光度计，96孔板及与之匹配的分光光度计。

 

关联产品:

甘氨酸羟甲基转移酶抽提试剂盒

 

备注：产品信息可能会有优化升级。请以实际标签信息和纸板说明书为准。（版本V0.58）