诺博莱德rRNAN-糖基化酶活性测定试剂盒

rRNA N-糖基化酶活性测定试剂盒（荧光光度法）

rRNA N-Glycosylase Assay Kit

目录号：53CBB022

规格：100T

保存：低温运输、-20℃保存，rRNA N-gly荧光底物液和重组rRNA N-gly酶液需-80℃保存，有效期半年。

产品简介:

本产品是荧光法测定rRNA N-糖基化酶（rRNA N-Glycosylase，rRNA N-gly，EC 3.2.2.22）活性的试剂盒。试剂盒采用含特定序列的荧光标记核酸为底物，经酶偶联处理后可在495 nm激发产生518 nm荧光，通过测定荧光值即可测定rRNA N-gly活性。

产品特点：

1.即开即用，用户不需要单独购买并优化每个成分。

2.使用便捷，整个实验可以在2小时内完成。

3.96孔板模式，尤其适合高通量检测。不适合比色皿检测。

4.可用于含重组或天然rRNA N-gly酶的样本。

5.提供重组的rRNA N-gly和荧光标准品。

6.本产品足够100次96孔板测定实验，每次40 μL反应体系。

7.一个rRNA N-糖基化酶活性单位的定义为37℃温度下每分钟释放1 pmol荧光物质的酶量。

8.本产品只可用于科研。(售前手册仅供参考，具体实验方案以出货手册为准。)

产品组成：

本产品采用小扁盒包装

成份	编号	规格	包装
rRNA N-gly荧光底物液	7-EC3.2.2.22s	2 mL	2 mL棕色管
2×rRNA N-gly反应液	7-EC3.2.2.22a	25 mL	30 mL本色瓶
5 ng/μL重组 rRNA N-gly酶液	28-EC3.2.2.22	50 μL	0.5 mL红盖管
5 μM荧光标准品溶液	7-EC3.2.2.22b	100 μL	0.5 mL棕色管
偶联酶干粉	EC3.2.2.22en	100 T	2.0 mL红盖管
通用酶储存液	7-251207	5 mL	5 mL本色瓶
DTT	CAS 3483-12-3	77 mg	1.5 mL本色管
使用手册	53CBB022sc	1份	无

自备试剂：

待测样品，超纯水，DMSO，96孔板（跟所用的荧光光度计兼容），可测495 nm激发光/518 nm发射光的荧光光度计。

使用方法（仅供参考）：

一、准备工作

1.首次使用本试剂盒时，在DTT管中加入1 mL自备超纯水，颠倒20次混匀后加20 μL到rRNA N-gly荧光底物液中，加500 μL到2×rRNA N-gly反应液中得到偶联酶溶液，轻柔颠倒20次混匀后待用。向偶联酶干粉中加入2 mL通用酶储存液，轻柔颠倒20次混匀后待用。没用完时上述溶液均存-20℃。

二、配制至少6个稀释度的荧光标准品

2.配制1 mL 1×rRNA N-gly反应液：在1个1.5 mL离心管中加入0.5 mL 2×rRNA N-gly反应液和0.5 mL自备超纯水，涡旋1分钟混匀，常温放置待用。

3.标记7个1.5 mL离心管，分别为0、1、2、3、4、5、6。

4.在每管中加入50 μL 1×rRNA N-gly反应液。盖上0号管作为对照。

5.在6号管中加入50 μL 5 μM 的荧光标准品溶液（试剂盒提供），涡旋1分钟混匀，得2.5 μM的荧光标准品稀释液。常温放置待用。

6.换枪头，在5号管中加入50 μL 2.5 μM 荧光标准品稀释液（上步稀释所得），涡旋1分钟混匀，得1.25 μM荧光标准品稀释液。常温放置待用。

7.换枪头，在4号管中加入50 μL 1.25 μM 荧光标准品稀释液（上步稀释所得），涡旋1分钟混匀，得0.625 μM荧光标准品稀释液。常温放置待用。

8.重复上面的操作，直到在1-6号管中得到2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078 μM共6个荧光标准品稀释液，加上0号管共7个样本。常温放置待用。此溶液每次需新鲜配制。

三、待测rRNA N-gly样本的制备

9.细胞培养上清液样本：收集培养细胞的上清，4℃ 1000×g离心10分钟，收集上清，取少量按1：1的比例跟2×rRNA N-gly反应液混合，放冰上待用。未用完的存-80℃。

10.细胞裂解液样本：4℃ 500×g离心10分钟收集细胞，加入适量自备的细胞裂解液（建议使用CHAP细胞裂解液）到细胞沉淀中，重悬细胞，冰上放置10分钟裂解细胞，用枪头吹打5次，将裂解液全部转移到1.5 mL离心管中，4℃ 10000×g离心5分钟，取少量按1：1的比例跟2×rRNA N-gly反应液混合，测定蛋白浓度，待用。未用完的存-80℃。

四、rRNA N-gly酶切反应设置

11.如有N个待测样本，每个做1次重复，则反应数为N+8，其中N个用于待测样本，1个用于空白对照，1个用于rRNA N-gly阳性对照，6个用于标曲样本。如每个样本做重复，则反应数应相应地变动。以下按1个样做1次重复示例。

12.在96孔板的各反应孔中按下表顺序加入各成分，反应总体积为40 μL。

13.摇晃30秒混合均匀，放37℃保温，每5分钟在495 nm激发光/518 nm发射光条件下记录一次荧光值，共30分钟。

五、数据分析

14.从所有数据中减去空白对照值，然后进行下面的计算。

15.制作标准曲线求转换系数：6-0号标准品的浓度分别为2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0 μM，反应体积为40 μL，故换算成绝对量分别为100、50、25、12.5、6.25、3.13、0 pmol，以其为横轴，以测出的荧光值为纵轴，得到标曲方程式。R2应大于0.95（如果不是线性，需要跟厂家联系），其斜率即为转换系数。

16.计算每个样本的斜率：以时间为横轴，以每个样本的荧光值为纵轴，得每个样本的线性区域（一般在前5-15分钟），然后计算出线性区斜率（速度）。

17.计算每个样本酶活性单位数：本试剂盒一个rRNA N-糖基化酶活性单位的定义为在37℃温度下每分钟释放1 pmol荧光物质的酶量，故40 μL体系中rRNA N-gly酶活性单位数=线性区斜率÷转换系数。

18.由于40 μL反应孔中加入的样本体积是20 μL，上步得到的酶单位数相当于20 μL待测样本的酶单位数，根据第9步或第10步计算出的蛋白浓度，可计算出20 μL样本中蛋白的μg数，则酶的比活=20 μL样本中的酶单位数/20 μL样本中的蛋白μg数。

19.本试剂盒提供的重组rRNA N-gly酶活性为71.85 U/mL，故比活为14.37 U/μg，如果所测结果跟此数字不同，请联系厂家，找到原因后再继续。

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rRNA N-糖基化酶抑制剂筛选试剂盒

 

备注：产品信息可能会有优化升级。请以实际标签信息和纸板说明书为准。（版本V5.0）