GST-pull-down

一、服务介绍

       将一个已知蛋白作为 “诱饵”，通过基因工程技术给其添加一个特异性标签（如 GST、His、Flag 等）。将带标签的诱饵蛋白与对应的亲和介质（如 GST - 谷胱甘肽树脂、His-Ni²⁺树脂）结合，使诱饵蛋白被固定在介质表面。将固定有诱饵蛋白的介质与含潜在 “靶蛋白” 的样品（可以是细胞裂解液、纯化的蛋白等）共同孵育。若靶蛋白与诱饵蛋白存在特异性相互作用，就会被诱饵蛋白捕获，形成 “诱饵 - 靶蛋白复合物” 并结合在介质上；无相互作用的杂蛋白则游离在溶液中。

二、亮点和服务特色

2.1 亮点

       1）蛋白间相互作用  2）高特异性  3）高灵敏度  4）适用于多种生物体系

2.2 服务特色

       GST Pull-Down 是一种基于亲和层析和蛋白质 - 蛋白质相互作用的体外实验技术，核心目的是验证两种已知蛋白质是否存在直接相互作用，或从复杂样品（如细胞裂解液）中筛选出与目标蛋白质结合的未知互作蛋白。

 

三、 服务优势

    1. 高特异性：实验的特异性由 “亲和标签 - 载体” 和“蛋白 - 蛋白互作” 双重机制保障，大幅减少非特异性结合带来的干扰。

    2. 灵活可控：GST Pull-Down 的体外实验体系具有极强的灵活性，可根据研究目标自由调节关键条件，满足多样化需求。

    3. 直接验证：GST Pull-Down 是体外重建的简化体系：实验中仅包含 “GST - 诱饵蛋白”、“猎物蛋白”（及必要缓冲成分），若能检测到猎物蛋白，可直接证明二者存在不依赖其他内源蛋白的直接相互作用。

四、 服务流程

五、客户提供

    蛋白序列信息

    1. 提供载体/模板：需要提供载体mcs测序报告/模板测序结果，如：测序报告则需另外收取测序费，由载基代为测序。

    2. 提供菌液：菌液量应≥0.5mL，放置1年以上的油菌需活化后送样。

    3. 提供质粒：质粒量≥5μg。

    4. 菌液和液态质粒均需冰袋运输。

六、实验交付

    1. 剩余质粒；

    2. 蛋白表达鉴定SDS-PAGE结果、蛋白纯化表达SDS-PAGE结果，蛋白Western Blot鉴定结果；

    3. 结题报告以及全部原始数据。

七、服务说明

    1. 可根据样本蛋白序列及基因序列进行蛋白表达预测分析，选择合适的载体与菌株，构建载体后进行诱导表达与蛋白纯化；

    2. 小量诱导蛋白表达SDS-PAGE、大量蛋白纯化进行互作实验分析；

    3. 在阴阳对照正常的前提下，若实验组IP中检测到另一蛋白条带，阴性对照中没有，说明两个蛋白能够互作，反之说明不互作。

服务名称	服务内容	交付内容及标准	周期
质粒构建	基因克隆	1、测序验证报告 2、包含表达质粒的大肠杆菌DH5a/TOP10 3、表达质粒	20个 工作日
	同源重组
	质粒转化表达载体
蛋白表达纯化	转化表达宿主菌株	4、阳性表达菌株 5、小试表达报告 6、蛋白表达报告 7、成品蛋白3mg	20个 工作日
	表达小试
	扩大培养
	亲和纯化
	SDS-PAGE、WB

八、案例展示

    1取自未诱导的菌液，2取自诱导后的菌液，3取自超声破碎后的菌沉淀，4取自超声破碎后的上清。

九、相关资源

1、GST-pull down 技术应用

    1) 蛋白质互作验证：直接验证体外条件下两个或多个已知蛋白质之间的特异性相互作用，明确互作的直接性与结合强度。

    2) 未知互作蛋白筛选：以目标蛋白为诱饵，从细胞裂解液、组织提取物等复杂样品中捕获并鉴定潜在的互作蛋白，挖掘新的功能关联分子。

    3) 蛋白质结合结构域分析：通过构建诱饵蛋白的截短体或突变体，确定介导蛋白质相互作用的关键结构域或氨基酸位点。

    4) 蛋白质 - 核酸互作研究：检测蛋白质与特定 DNA 或 RNA 序列的结合能力，如转录因子与启动子的相互作用、RNA 结合蛋白与靶标 RNA 的结合等。

    5) 药物研发辅助：筛选能干扰或促进特定蛋白质相互作用的小分子化合物，评估候选药物对靶标互作的影响，为药物靶点验证提供依据。

    6) 信号通路解析：鉴定信号通路中关键蛋白的上下游互作分子，阐明信号传递的分子机制，如激酶与底物、受体与配体之间的相互作用关系。

    7) 微生物学研究：探究病原微生物蛋白与宿主细胞蛋白的相互作用，揭示病原体入侵、感染及致病的分子机制。

    8) 蛋白质翻译后修饰对互作的影响：分析磷酸化、泛素化等翻译后修饰是否调控蛋白质之间的相互作用，以及修饰后的互作强度变化。

2、GST-pull down 实验流程

    1) 构建与表达 GST 融合蛋白：设计特异性引物扩增目的基因（诱饵蛋白），将其与 GST 标签基因融合并克隆到原核表达载体中，转化大肠杆菌后通过 IPTG 诱导表达 GST - 诱饵融合蛋白，经亲和层析纯化获得高纯度融合蛋白。

    2) 制备待检测样品：若检测与已知蛋白的互作，需表达并纯化该目标蛋白（可带 His 等标签便于后续检测）；若筛选未知互作蛋白，则裂解细胞或组织，离心取上清获得总蛋白提取物。

    3) 孵育与结合：将纯化的 GST - 诱饵融合蛋白与 GST 亲和树脂孵育，使融合蛋白通过 GST 标签结合到树脂上；加入待检测样品（目标蛋白或总蛋白提取物），在适宜条件（如 4℃）下缓慢摇晃孵育，让互作分子充分结合。

    4) 洗涤与分离：用含不同浓度盐离子的缓冲液多次洗涤树脂，去除非特异性结合的蛋白；加入洗脱缓冲液（如含还原型谷胱甘肽）洗脱结合的蛋白复合物。

    5) 检测与分析：通过 SDS-PAGE 分离洗脱的蛋白复合物，若为已知互作蛋白，可经 Western Blot（用标签抗体或特异性抗体）验证；若为筛选未知蛋白，则对凝胶中的特异性条带进行质谱鉴定，确定互作蛋白身份。

3、GST-pull down 实验优化与注意事项

    1) 融合位点选择需避开诱饵蛋白的功能结构域（如结合活性位点、酶活中心），避免 GST 标签干扰蛋白互作；优先选择 N 端或 C 端融合（若某一端融合影响蛋白折叠，可尝试另一端）。

    2) 确保融合蛋白正确折叠与活性：通过 SDS-PAGE 验证纯化后蛋白的纯度（目标条带单一，无明显杂带），若需进一步确认活性，可结合酶活实验（针对酶类诱饵）或已知互作蛋白的预实验（验证结合能力），避免因蛋白错误折叠导致假阴性。

    3) 温度与时间：常规选择 4℃孵育（减少蛋白降解，降低非特异性结合），孵育时间需根据互作强度调整（弱互作可延长至 12-16 小时，强互作 4-6 小时即可），避免过短导致结合不充分或过长增加非特异性结合。

    4) 缓冲液成分：缓冲液需含温和的盐离子（如 100-150mM NaCl，过高易破坏互作，过低增加非特异性结合）、蛋白酶抑制剂（如 PMSF、蛋白酶抑制剂 cocktail，防止蛋白降解）和磷酸酶抑制剂（若研究磷酸化依赖的互作）；可添加 0.1%-0.5% Triton X-100 增强蛋白溶解性，但需避免高浓度去污剂破坏蛋白互作。

    5) 洗涤缓冲液需与孵育缓冲液成分一致（仅可调整盐浓度），通过梯度提高盐浓度（如从 150mM 逐步升至 300mM NaCl）去除非特异性结合蛋白，同时需检测目标互作是否被高盐破坏（可通过预实验验证）。

    6) 洗涤次数与体积：每次洗涤需用至少 10 倍树脂体积的缓冲液，反复洗涤 3-5 次，确保充分去除未结合或弱结合的杂蛋白，但避免过度洗涤导致特异性复合物脱落。

    7) 对照实验的设置（关键防假阳性 / 假阴性）：阴性对照：① 仅用 GST 蛋白（无诱饵片段）与树脂结合后孵育待检测样品，排除 GST 标签本身与目标蛋白的非特异性结合；② 待检测样品单独与树脂孵育，排除样品中蛋白与树脂的非特异性吸附。阳性对照：使用已知与诱饵蛋白互作的蛋白作为待检测样品（如已报道的互作对），验证实验体系的有效性，确保实验流程无技术误差。

    8) 待检测样品（细胞 / 组织裂解液）需新鲜制备，避免反复冻融导致蛋白降解；离心时需保持低温（4℃），且转速足够（如 12000g 离心 15 分钟），确保去除细胞碎片，避免杂质干扰结合。

    9) 检测方法选择：若验证已知互作，Western Blot 需使用特异性抗体（如目标蛋白的标签抗体或自身抗体），确保抗体特异性（无交叉反应）；若筛选未知互作，SDS-PAGE 凝胶需选择合适浓度（根据目标蛋白分子量），且质谱鉴定前需切取清晰的特异性条带（避开 GST 诱饵蛋白条带），减少杂蛋白干扰。

    10) 纯化过程中需避免反复冻融 GST 融合蛋白，可将纯化后的蛋白分装保存于 - 80℃，并添加 50% 甘油提高稳定性，防止蛋白变性影响后续结合实验。