Me-RIP甲基化免疫共沉淀

▶ 服务介绍

甲基化RNA免疫共沉淀（MeRIP/m6A-seq）是通过特异性抗体富集含m6A修饰的RNA片段，结合高通量测序或qPCR分析转录组-wide甲基化分布的技术。利用抗m6A抗体与随机打断的RNA片段孵育，沉淀修饰片段后进行下游检测（测序/qPCR）。

▶ 实验步骤

1. Total RNA样品检测
    在进行MeRIP实验之前，首先需要对RNA样品进行检测以确保其质量和数量满足后续实验的要求：
    琼脂糖凝胶电泳分析：检测RNA的降解程度及是否存在污染，确保具有明显的18S或28S主带且条带清晰。
    Qubit2.0精确量化：对RNA浓度进行精确测量，总RNA检测总量不低于10μg。
    Agilent2100完整性检测：检测RNA的完整性，RIN值不低于7.5。
2. RNA片段化
    取10μg总RNA，加入RNA片段化试剂（如Invitrogen提供的试剂），在70℃下反应10分钟，将RNA打断成约100nt的片段。随后使用乙醇法将片段化的RNA沉淀。
3. m6A富集
    这是MeRIP实验的核心步骤之一，旨在通过抗体特异性结合m6A修饰的RNA片段来富集目标RNA：
    将含有Protein A和Protein G的磁珠用IP缓冲液（如150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7.5）洗涤。
    与5μg m6A抗体（如Millipore提供的抗体）在4℃下孵育2小时。用IP缓冲液洗涤磁珠两次，再用IP缓冲液重悬磁珠，加入片段化的RNA，在4℃下翻转孵育4小时。
    用IP缓冲液在4℃下洗涤磁珠三次，再用m6A竞争性洗脱液在4℃下孵育1小时。
    收集含有洗脱m6A RNA的上清至新的试管中，并使用苯酚:氯仿:3-甲基丁醇（125:24:1）进行纯化。
4. 文库构建
    使用SMARTer® Stranded Total RNA-seq Kit v2-Pico Input Mammalian User Manual根据说明书对IP与Input样品进行反转录及文库构建。利用AMPure XP bead进行片段大小选择，获得最终文库。
5. 文库质检
    文库构建完成后，需要对其进行质量检测：
    使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至1ng/μl。
    使用Agilent2100对文库的插入片段大小进行检测，确保插入片段大小符合预期。
    使用qPCR方法对文库的有效浓度进行准确定量（文库有效浓度应为2nM），以确保文库质量。
6. 上机测序
    文库检测合格后，根据不同文库的有效浓度及目标下机数据量的需求进行混合，并在Illumina Nova平台测序，测序策略为PE150。
7. 信息分析流程
    原始下机数据质控：对测序数据进行初步处理，去除低质量读段。
    比对参考基因组：将高质量读段比对到参考基因组上。
    peak calling：识别m6A修饰的热点区域。
    功能注释：对识别出的m6A修饰区域进行功能注释，分析其可能参与的生物学过程