测甲基化

DNA甲基化检测技术的研究进展与应用

 

DNA甲基化作为表观遗传修饰的核心机制之一，在基因表达调控、细胞分化、胚胎发育及疾病发生中发挥关键作用。这一过程主要指胞嘧啶第五位碳原子共价结合甲基基团（形成5-甲基胞嘧啶），常见于CpG二核苷酸序列。哺乳动物基因组中约70%-80%的CpG位点存在甲基化修饰，其动态变化与肿瘤、神经退行性疾病、代谢综合征等病理过程密切相关。高通量测序技术的发展使得全基因组甲基化图谱的绘制成为可能，而靶向检测方法则能jīngzhǔn解析特定基因位点的甲基化状态。目前测甲基化技术已从早期的限制性内切酶消化和亚硫酸氢盐转化，发展到单分子实时测序（SMRT）和纳米孔测序等第三代技术，分辨率从群体水平提升至单细胞尺度。在肿瘤早筛领域，循环游离DNA（cfDNA）的甲基化特征被证明比突变检测更具组织特异性；在农业育种中，甲基化标记辅助筛选可缩短育种周期。具体费用需要根据实验需求和样品情况来确定，但技术选择需权衡覆盖度、灵敏度和样本通量等核心参数。

 

主流测甲基化技术方法

 

基于亚硫酸氢盐转化的全基因组甲基化测序（WGBS）仍是金标准，其通过未甲基化胞嘧啶转化为niàomìdìng的特性，可实现单碱基分辨率检测，但存在DNA降解严重和GC偏好性问题。简化代表性亚硫酸氢盐测序（RRBS）通过限制性酶切富集CpG密集区域，将数据量降低至WGBS的20%-30%，更适合大样本队列研究。甲基化芯片（如Illumina EPIC array）覆盖约850,000个CpG位点，成本效益比突出，但无法发现未知位点变异。新兴的酶学转化方法（如EM-seq）通过TET2和APOBEC实现温和转化，能将DNA片段长度保留率提升至90%以上。单细胞甲基化测序（scBS-seq）需结合多重退火引物扩增（MALBAC）等技术，但等位基因丢失率仍是技术瓶颈。

 

技术应用与挑战

 

在肿瘤异质性研究中，10x Genomics单细胞甲基化联合测序可同时获取染色质可及性和甲基化数据，揭示克隆演化表观驱动机制。然而，ctDNA甲基化检测面临丰度低（常<0.1%）的挑战，数字PCR和靶向甲基化测序（如甲基化特异性PCR-MSP）可将检测限推进至0.01%。植物甲基化研究需注意5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）的干扰，TAB-seq或oxBS-seq等化学标记法可实xiànjīngquè区分。空间转录组结合甲基化分析（如Visium HD）正在推动组织微环境表观调控研究，但数据整合算法仍需优化。

 

常见问题：

Q1. 亚硫酸氢盐转化中不wánquán转化如何影响甲基化定量准确性？

A：不wánquán转化会导致假阳性甲基化信号，可通过加入spike-in对照（如Lambda DNA）计算转化效率，当效率<99%时需使用生物信息学工具（如Bismark）进行校正，或改用氧化亚硫酸氢盐处理（oxBS-seq）消除5hmC干扰。

 

Q2. 单细胞甲基化数据中如何区分技术噪音与生物学差异？

A：建议采用UMI标记消除PCR重复偏差，结合深度学习模型（如DeepCpG）预测缺失值。同时需设置同一细胞系的技术重复，通过计算熵值（entropy score）评估数据一致性，通常要求差异甲基化区域（DMRs）的FDR<0.05且甲基化差异>25%。