磷酸化akt蛋白怎样跑

磷酸化Akt蛋白的Western Blot检测技术要点

 

磷酸化Akt蛋白的检测是研究细胞信号转导通路（如PI3K/Akt/mTOR通路）的关键实验手段，其核心是通过Western Blot技术实现目标蛋白的特异性分离与鉴定。磷酸化Akt蛋白怎样跑涉及多个关键步骤，包括样品制备、SDS-PAGE电泳、转膜、抗体孵育及显影。首先，细胞或组织样本需在裂解缓冲液（如RIPA）中提取总蛋白，并加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂以防止蛋白降解和去磷酸化。蛋白浓度测定后，需通过加热变性（95°C，5分钟）使蛋白线性化，并加入还原剂（如β-巯基乙醇）和二硫键断裂剂（如DTT）以确保蛋白充分解聚。

 

磷酸化Akt蛋白怎样跑的核心在于电泳条件优化。通常采用10%-12%的分离胶，浓缩胶浓度为5%，以有效分离分子量约为60 kDa的Akt蛋白及其磷酸化形式（如p-Akt Ser473或Thr308）。电泳电压建议设置为80 V（浓缩胶）和120 V（分离胶），直至溴酚蓝指示剂到达凝胶底部。转膜阶段需根据磷酸化Akt蛋白的分子量选择0.45 μm PVDF膜（适用于>20 kDa蛋白），转膜条件为100 V恒压1小时或30 V过夜。封闭液常用5%脱脂牛奶或BSA，但磷酸化蛋白检测推荐使用BSA以减少非特异性结合。

 

磷酸化Akt蛋白怎样跑的抗体选择至关重要。一抗需特异性识别磷酸化位点（如抗p-Akt Ser473抗体），二抗则根据一抗来源选择HRP标记的相应种属抗体。显影可采用ECL化学发光法，通过调整曝光时间获取清晰信号。实验成本因抗体品牌、试剂用量和检测系统而异，具体费用需要根据实验需求和样品情况来确定。

 

常见问题：

 

Q1. 磷酸化Akt蛋白检测中为何出现高背景噪声？

A：高背景可能源于封闭不充分、抗体浓度过高或洗膜不chèdǐ。建议优化封闭时间（1小时至过夜）、调整一抗稀释比例（1:1000至1:2000），并增加TBST洗涤次数（3次×10分钟）。

 

Q2. 磷酸化Akt蛋白信号弱或无信号的可能原因？

A：可能由于样本处理不当（如磷酸酶抑制剂缺失）、蛋白上样量不足（建议20-50 μg）或抗体失效。需验证抗体活性，并确保转膜效率（可通过丽春红染色检查）。

 

Q3. 如何区分磷酸化Akt与非磷酸化Akt的条带位置？

A：磷酸化通常导致蛋白迁移速率轻微变慢，在凝胶中磷酸化Akt条带略高于非磷酸化形式。可通过平行运行磷酸酶处理样本作为阴性对照加以确认。