- ￥600 - 2800
- 磷酸化蛋白跑western需要注意什么
- 全国
- 2025年08月01日
企业认证
万千商家帮你免费找货
0 人在求购买到急需产品
- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 提供商：
北京百泰派克生物科技有限公司
- 服务名称：
磷酸化蛋白跑western需要注意什么
- 规格：
询价
磷酸化蛋白Western blot实验的关键技术要点
磷酸化蛋白Western blot是研究dànbáizhì翻译后修饰的重要技术手段，其技术难点主要源于磷酸化修饰的动态性、低丰度以及抗体特异性要求。实验成功的关键在于从样品制备到抗体孵育的全流程优化。在样品处理阶段，必须使用新鲜制备的含有磷酸酶抑制剂的裂解液（如RIPA buffer补充NaF和β-甘油磷酸钠），并保持全程低温操作以维持磷酸化状态。蛋白酶抑制剂混合物需与磷酸酶抑制剂联合使用，具体费用需要根据实验需求和样品情况来确定。电泳环节建议采用10%-12%的Tris-Glycine胶或Bis-Tris预制胶，后者更适合磷酸化蛋白的分离，能减少酸性条件下磷酸基团的水解。
转膜参数需要针对性调整，对于分子量小于20 kDa的磷酸化蛋白推荐使用0.2 μm PVDF膜并结合半干转系统（电流2.5 mA/cm²，时间30分钟），而大于50 kDa的蛋白可采用湿转法（100 V，90分钟）。封闭液的选择直接影响信噪比，5% BSA在室温封闭1小时比脱脂奶粉更能减少非特异性结合，尤其对làoānsuān磷酸化检测至关重要。一抗孵育应使用经过验证的磷酸化特异性抗体，稀释比例需通过预实验确定，典型条件下4℃过夜孵育比室温2小时能提高信号强度3-5倍。值得注意的是，磷酸化蛋白Western blot需要设置严格的对照，包括：①总蛋白抗体对照验证上样量；②非磷酸化抗体对照确认修饰特异性；③磷酸酶处理样品作为阴性对照。
化学发光检测阶段，建议采用超敏ECL底物（如Pierce ECL Plus）并优化曝光时间，因磷酸化信号通常较弱。定量分析时需注意磷酸化水平应标准化至对应总蛋白而非管家蛋白，β-actin不适合作为磷酸化蛋白的内参。数据重复至少3次生物学重复，统计分析推荐使用非参数检验方法。
常见问题：
Q1. 为什么磷酸化信号在重复实验中波动较大？
A：这主要与磷酸化修饰的动态特性相关。需确保：①样品处理时间一致（尤其刺激实验）；②立即加入裂解液终止反应；③使用新鲜制备的蛋白酶/磷酸酶抑制剂。建议在实验全程监测磷酸酶活性，可通过添加外源性磷酸酶底物（如pNPP）进行质量控制。
Q2. 如何区分非特异性条带与真实磷酸化信号？
A：可采用三重验证法：①使用两种不同表位的磷酸化抗体交叉验证；②通过siRNA敲低目标蛋白后观察条带消失；③质谱鉴定条带中的磷酸化位点。特别要注意某些磷酸化抗体会识别相同磷酸化基序的不同蛋白，这时需结合分子量预测和IP-WB联用技术确认。
风险提示：丁香通仅作为第三方平台，为商家信息发布提供平台空间。用户咨询产品时请注意保护个人信息及财产安全，合理判断，谨慎选购商品，商家和用户对交易行为负责。对于医疗器械类产品，请先查证核实企业经营资质和医疗器械产品注册证情况。
文献和实验相关专题 在western blot ting 方面，本文绝对是一个新手，目前正准备磷酸化蛋白的Western，急需这方面的实验技术操作步骤和一些注意事项的指导。在网络上搜集整理了一个western blot实验达人的建议，供大家参考。 我做了很久的western blot ，尤其是phospho-抗体，可以算是达人了。我根据自己的经验，对磷酸化蛋白之western blot提出以下建议，供刚入门的同仁参考
【求助】多少数量的细胞可以提磷酸化蛋白做western blot？
dongfangzhizi06 我要做信号通路(ERK和p38)，请问多少数量的细胞可以提磷酸化蛋白做western blot检测p-ERK1/2和p-p38？六孔板的一个孔够吗？ 谢谢！ 民间恺撒 上次我接板时的密度是5×105，提了四个孔的总蛋白，大概浓度在8.5左右。建议6孔板可以使用两个孔叠加在一起，这样蛋白浓度会有所保证。 bianbenjamin 我都是六孔板一个孔做
的well中上样两次（可在相同的gel上，也可在不同的gel），其一压磷酸化蛋白，另一压该蛋白总的表达量（包括磷酸化和未磷酸化的该蛋白），甚至还可跑另一个gel，压内标。但是不建议如此做，因为这样比较时误差还是较大的。12. Strip时一定要注意：membrane一定要完全泡在strip solution中（可用较硬的塑料膜封好），然后要完全浸入水中，使受热均匀。这一点很重要，要不然，随后压出来的总蛋白也好，内标也好就会不均一，无法进行比较。
技术资料暂无技术资料 索取技术资料
