细胞蛋白质组学样品收集

细胞蛋白zhìzǔxué样品收集的关键技术与方法

 

细胞蛋白zhìzǔxué样品收集是蛋白zhìzǔxué研究的dìyī步，其质量直接影响后续质谱分析的可靠性和数据解读的准确性。在实验设计阶段，研究人员需综合考虑细胞类型、培养条件、裂解方法以及dànbáizhì稳定性的维持策略。对于贴壁细胞，常用yíméi消化或细胞刮取法收集，但需注意避免过度消化导致的dànbáizhì降解；悬浮细胞则可通过离心直接富集。无论哪种细胞类型，均需在裂解前用预冷的PBS洗涤以去除培养基残留，这一步骤对减少后续质谱检测中的高丰度血清蛋白干扰尤为关键。

 

样品收集过程中的温度控制至关重要，操作应在冰上进行并使用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液，例如RIPA或urea/thiourea缓冲体系。对于磷酸化dànbáizhì组等特殊研究，还需添加特定 phosphatase抑制剂。机械破碎（如超声）与化学裂解（如SDS）的联用可提高疏水性膜蛋白的提取效率，但需注意SDS会干扰后续yíméi消化，需通过过滤辅助样品制备(FASP)或bǐngtóng沉淀等方法去除。

 

临床样本（如循环肿瘤细胞或穿刺活检组织）的收集更具挑战性，需在30分钟内完成液氮速冻或置于专用保存液（如Allprotect）。对于微量样品（<10,000个细胞），建议采用单管处理避免转移损失，并使用兼容低上样量的裂解缓冲液（如0.1% RapiGest）。具体费用需要根据实验需求和样品情况来确定，但核心在于选择与下游分析平台匹配的制备方案——LC-MS/MS通常需要更严格的去盐步骤，而抗体芯片则需避免强变性剂。

 

样品收集的标准化与质量控制

 

国际临床蛋白zhìzǔxué肿瘤分析联盟(CPTAC)推荐采用BCA定量结合SDS-PAGE考染作为质控双验证，电泳条带应显示清晰的分子量分布且无明显降解（如55kDa处的β-actin条带锐利）。对于时间序列实验，所有样品需使用同一批次的裂解缓冲液，并记录jīngquè的裂解时间（误差<2分钟）。近年发展的微流控细胞分选技术可实现单细胞水平的dànbáizhì组样品收集，但需配套特殊的低吸附离心管和纳升级裂解系统。

 

常见问题：

 

Q1. 如何处理高脂质含量的细胞（如脂肪细胞或神经元髓鞘）样品以避免质谱离子抑制？

A：采用分步提取策略，先用氯仿/甲醇(2:1)去除脂质，再用8M尿素提取dànbáizhì。关键控制点是两相分离后需chèdǐ挥发有机溶剂，残留氯仿会烷基化赖氨酸残基。建议通过空白对照监测修饰水平。

 

Q2. 跨膜蛋白在常规裂解缓冲液中回收率低，如何优化收集方法？

A：推荐使用含4% CHAPS的裂解液结合短暂超声（10秒脉冲，振幅30%），或改用60mM n-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(OG)增溶。需注意OG会干扰BCA定量，应改用660nm的Pierce检测法。对于大规模膜dànbáizhì组，可先进行膜富集（蔗糖密度梯度离心）再裂解。