甲基化测定方法

DNA甲基化测定技术的原理与应用

DNA甲基化作为表观遗传修饰的核心机制之一，在基因表达调控、细胞分化及疾病发生中起关键作用。其测定方法的发展为肿瘤早筛、衰老研究和发育生物学提供了重要工具。目前主流技术可分为三大类：基于亚硫酸盐转化的全基因组/位点特异性分析、甲基化敏感限制性内切酶法，以及新兴的单分子测序技术。亚硫酸盐处理通过将未甲基化胞嘧啶转化为niàomìdìng，而保留甲基化胞嘧啶的特性，成为金标准方法的重中之重。全基因组甲基化测序（WGBS）可实现单碱基分辨率，但数据量需求较大；简化代表性亚硫酸氢盐测序（RRBS）则通过酶切富集CpG岛区域显著降低成本。甲基化特异性PCR（MSP）和焦磷酸测序因其高灵敏度和定量能力，在临床标志物验证中广泛应用。具体费用需要根据实验需求和样品情况来确定。

近年来，第三代测序技术如PacBio SMRT和Oxford Nanopore可直接检测甲基化修饰，避免了亚硫酸盐处理导致的DNA损伤。纳米孔测序通过电流信号差异识别5mC和5hmC，在长读长应用中展现优势。同时，微阵列技术如Illumina Infinium MethylationEPIC BeadChip以高性价比实现>850K位点筛查，适用于大样本队列研究。值得注意的是，靶向甲基化测序通过探针捕获特定区域（如启动子或增强子），在循环肿瘤DNA分析等场景中显著提升检测效率。实验设计时需权衡覆盖度、分辨率和样本通量，例如ChIP-seq与甲基化测序联用可揭示组蛋白修饰与DNA甲基化的协同调控网络。

样本前处理是影响甲基化测定方法准确性的关键环节。FFPE样本需优化DNA提取方案以应对交联损伤，而血浆游离DNA则需超低起始量建库技术。质量控制指标包括亚硫酸盐转化率（需>99%）和PCR重复性验证。针对不同碱基修饰类型，TET酶氧化辅助的oxBS-seq可区分5mC与5hmC，而酶学标记法则能检测6mA等原核生物特征性修饰。数据分析时，比对工具如Bismark需考虑亚硫酸盐转化导致的序列变异，而DSS、methylKit等R包可完成差异甲基化区域统计。

常见问题：

Q1. 如何解决亚硫酸盐转化不wánquán导致的假阳性问题？

A：建议采用spike-in对照（如Lambda DNA）定量监测转化效率，并通过三重重复实验验证低甲基化位点。新一代化学转化试剂已可将效率提升至99.8%，同时降低DNA片段化风险。

Q2. 单细胞甲基化测序中如何克服等位基因脱扣（allelic dropout）？

A：采用多重退火循环扩增（MALBAC）或转座酶预扩增（scMT-seq）可提升基因组覆盖均一性。zuìxīn微流控平台如Fluidigm C1能实现单细胞分选与全基因组扩增同步优化，将等位基因检出率提高至90%以上。