蛋白质组学样品制备方法有哪些

蛋白zhìzǔxué样品制备方法的技术体系与发展现状

蛋白zhìzǔxué样品制备是蛋白zhìzǔxué研究的关键dìyī步，其质量直接影响后续质谱分析的准确性和覆盖度。根据样品来源和实验目标的不同，蛋白zhìzǔxué样品制备方法可分为三大技术路线：溶液内消化法、凝胶内消化法以及基于固相支持物的制备方法。溶液内消化法（In-solution digestion）适用于大多数可溶性蛋白样品，通过变性剂（如尿素、SDS）破坏dànbáizhìgāojí结构，还原剂（如DTT、TCEP）打开二硫键，烷基化试剂（如diǎnyǐxiān胺）封闭游离巯基，zuì后经yídànbáiméi在液相环境中完成酶切。该方法通量高且操作简便，但对复杂样品可能存在酶切效率不均的问题。凝胶内消化法（In-gel digestion）主要针对SDS-PAGE或2D凝胶分离后的蛋白条带/斑点，通过胶内脱色、还原烷基化和原位酶切等步骤实现目标蛋白的提取，特别适用于低丰度蛋白或需预先分离的样品，但流程耗时且回收率受胶基质影响显著。固相支持物制备法（如FASP、S-Trap）利用功能性材料（滤膜、磁珠等）在固液界面完成蛋白纯化与酶切，能有效去除去垢剂和盐类干扰，但固相载体的选择需要根据样品特性优化。

对于特殊样本类型，蛋白zhìzǔxué样品制备方法需针对性调整。组织样本需先通过机械研磨或超声破碎实现匀浆，临床液体样本（如血浆、脑脊液）常需高丰度蛋白去除柱预处理，而膜蛋白等难溶组分则需加入强变性剂（如RapiGest）或有机溶剂辅助溶解。近年来，微流控芯片整合裂解、富集和酶切的一体化平台显著提升了微量样品（<1 μg）的处理效率。化学标记（TMT、iTRAQ）或代谢标记（SILAC）等定量策略的引入，使蛋白zhìzǔxué样品制备方法还需兼容标记试剂的反应条件。具体费用需要根据实验需求和样品情况来确定，但技术选择的核心标准始终是保持蛋白完整性、zuì大化回收率并减少人为修饰。

在自动化发展方面，96孔板格式的高通量制备系统和机器人移液工作站大幅提升了蛋白zhìzǔxué样品制备方法的重复性，特别是对于临床大队列研究。样品制备过程中的质量控制点包括：BCA/Lowry法定量、SDS-PAGE检测降解程度、酶切效率评估（通过标准蛋白监测）等。新兴的声波辅助酶切（PEP）技术将传统12-16小时的酶切时间缩短至30分钟，而基于亲和富集的磷酸化/糖基化修饰组学样品制备方法则需在常规流程中增加TiO2或凝集素柱步骤。值得注意的是，样本采集阶段的预处理（如速冻、蛋白酶抑制剂添加）同样属于蛋白zhìzǔxué样品制备方法的关键环节，低温研磨仪和真空冷冻干燥仪等设备可有效保持样本原始状态。

常见问题：

Q1. 如何处理高脂质含量的生物样本（如脑组织、脂肪）以减少质谱离子抑制效应？

A：采用氯仿/甲醇沉淀法可同步去除脂质和盐分，或使用SPE脂质去除柱。对于jíduān样本，建议增加有机相（60%yǐjīng）洗涤步骤，但需评估蛋白损失率。

Q2. 微量细胞样本（<10,000个细胞）制备时如何避免载体蛋白污染？

A：选用无载体蛋白的裂解缓冲液（如0.1% RapiGest的50mM TEAB），并采用StageTip C18柱进行皮升级脱盐。建议搭配单细胞专用低吸附离心管操作。