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文献和实验【专题讨论】杆状病毒——昆虫细胞蛋白表达系统,影响蛋白表达的因素?
方法扩增P3贮液,用于高效表达。 三、 病毒贮液初步鉴定 1. SDS-PAGE蛋白电泳:取P2或P3病毒贮液浓缩后上样(或直接上样)进行SDS-PAGE蛋白电泳,初步根据分子量对表达蛋白进行鉴定。 CAT-his融合蛋白分子量约为28KDa,nsp6-his融合蛋白分子量约为34KDa。 2. western blot:以小鼠抗his单克隆抗体鉴定在相应条带出是否有his标记。 3. 以CAT-ELISA检测试剂盒检测Bacmid/CAT对照的蛋白表达情况。方法详见CAT
膜的改变是这些特征中较早出现的一种。在凋亡细胞中,细胞膜磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的外侧。Annexin-V是一种35-36 KD的钙粒子依赖的磷脂结合蛋白,它对PS具有较高的亲和力。细胞凋亡时,可以和外翻的PS结合,从而可以检测凋亡的细胞。发生坏死的细胞其细胞膜上的PS也外翻,因而也会阳性。因此,常用的凋亡试剂盒除了采用Annexin-V标记之外,还会加一种DNA染料,常用的有PI和7-AAD,由于坏死的细胞膜通透性增高,染料可以进入细胞内和DNA结合,从而可以发荧光,区分出坏死
)与免疫球蛋白标记碱性磷酸脂酶(戊二醛一步法),按常规方法制备。 抗IgG型抗体酶结合物也可用金黄色葡萄球菌A-蛋白酶结合物替代,称A-蛋白酶联试验(SPA-ELISA)。A-蛋白辣根过氧化物酶结合物(PA-HRP)已有市售标准品,其敏感度稍逊于抗体酶结合物。 底物配制:不同的酶要求选择相应底物,以下为分别适用于比色和肉眼读取结果的两种HRP常用底物配制。 邻苯二胺(OPD):经HRP催化后生成橘红色产物。40mgOPD溶于柠檬酸磷酸
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