Direct RNA-seq

Direct RNA-seq

 

细胞的转录组包含丰富的信息，包括基因结构（如剪接变异和融合基因）、转录本的不同表达水平、反义转录，以及RNA上的表观修饰。基于Illumina平台等二代cDNA测序、ONT和Pacbio平台的三代全长cDNA测序已经很全面地描绘了转录组景观，但仍然存在一定的问题。比如二代测序平台采用Oligod(dT) 逆转录全长cDNA，或将RNA片段化后用随机引物逆转录成cDNA，最后使用PCR扩增出文库进行测序；三代测序平台比如Nanopore同样采用Oligod(dT) 逆转录全长cDNA，PCR扩增出文库后测序。由于这些方法中，cDNA经过PCR 扩增，这可能会引起扩增偏好性、降低cDNA文库的复杂度、干扰表达丰度定量以及影响某些RNA类型的检出。

有没有一种可以准确、区分链特异性，能够同时鉴定RNA修饰碱基的种类，而且不必担心在文库制备时PCR造成的伪影的方法？Nanopore Direct RNA-seq可以满足您对转录组的一切想象。

Direct RNA-seq测序原理

 

Nanopore Direct RNA-seq的基本原理是：单个DNA分子首先在施加的电势下进入纳米孔，然后通过解旋酶马达调控天然RNA的运动速度，使其逐个碱基地通过孔。在此过程中，流经孔的离子电流取决于流经孔的碱基序列，通过在大量RNA测序数据上训练的神经网络将这种离子电流特征转换成RNA序列（下图左），同时通过比较具有修饰和未修饰的RNA碱基电流信号的不同，或统计发生修饰位置错配率明显升高，就可以鉴定相应的RNA修饰（下图右，蓝色曲线代表存在修饰的RNA）。

 

 

Direct RNA-seq建库原理

 

Direct RNA-seq建库步骤主要有：

1. PolyA捕获富集Poly(A)+ RNA

2. 利用Oligo dT逆转录成cDNA第一链（RNA起始量要求高，测序时间更长，数据量产出更高）；

3. Direct RNA测序；

 

 

Direct RNA-seq应用

 

鉴定RNA修饰

 

     DRS鉴定RNA修饰的流程：

1. MinKNOW软件对电流强度信息进行采集和处理，生成Fast5格式文件；

2. Guppy等软件对Fast5进行Base-calling生成FastQ格式文件；

3. FastQ文件可以通过比对软件如minimap2进行参考基因组比对，生成bam文件。

4. DRS RNA修饰鉴定目前有三种策略：

a. 以非随机base-calling错配的形式识别RNA修饰，表现为修饰位点相比上下游位置Base-calling错误率增加（下图①）；

b. 对比有修饰和无修饰位置的原始电流强度（信号强度、停留时间或迹线特征）来识别RNA修饰（下图②）；

c. 在进行Base-calling步骤时，使用感知修饰（Modification-aware）Base-calling模型，而不使用预测4种碱基的常规Base-calling模型。

 

目前已经开发出很多软件用于DRS的RNA修饰鉴定，如下表，康测m6A修饰检测使用的是MINES软件。

修饰	软件	训练模型物种	分辨率
m6A	DENA	Arabidopsis	Read
	nanom6A	Arabidopsis; Human; IVT; Populus trichocarpa	Read
	EpiNano	IVT; Yeast	Site
	m6Anet	Human	Read
	MINES	Human	Site
	Nanocompore	Human; IVT	Site
多种修饰	xPore	Human	Read
	Yanocomp	Arabidopsis	Read
	DiffErr	Arabidopsis	Site
	DRUMMER	Human	Site
	nanoDoc	Yeast; E. coli; IVT	Site
	ELIGOS	Human; IVT; Yeast; E. coli	Site
	NanoRMS	Yeast	Read
5EU	nano-ID	Human	Read
ψ	Penguin	Human	Read
2’-O-met	NanoNm	Human	Site

A. 康测DRS实测数据（展示m6A修饰在RNA功能区分布） B. 康测DRS实测m6A保守motif

 

鉴定可变剪接种类

 

与Nanopore cDNA测序一致，DRS也可以鉴定基因的可变剪接，以及定量其产生的转录本。

 

 

康测实测可变剪接种类统计

*SE：外显子跳跃；MX：互斥外显子；A5：5’端可变剪接位点；A3：3’端可变剪接位点；

RI：内含子保留；AF：第一个外显子可变选择；AL：最后一个外显子可变选择

 

鉴定PolyA长度和APA位点

 

  DRS除了可以鉴定各种RNA修饰、可变剪接种类以外，还可以直接鉴定APA位点和PolyA尾长度，如下图。

 

 

康测实测PolyA长度分析

 

Direct RNA-seq RNA修饰文献案例

A.

B.

C.

D.

E.

F.

G.

H.

I.

J.

K.

L.

 

2'-O-甲基化（2'-O-Methylation，简称Nm）是一种特殊的核苷酸修饰，它能够作用于包括腺嘌呤（A）、尿嘧啶（U）、胞嘧啶（C）和鸟嘌呤（G）在内的多种核苷酸。Fibrillarin（FBL）是一种重要的癌基因，特别是在TP53基因发生突变后，FBL会被异常激活。它的激活不仅促进了rRNA的2'-O-甲基化修饰，还加快了癌蛋白的翻译速度，从而参与了前列腺癌以及其他多种肿瘤的发展过程。本研究的结果包括：

1. 公共数据寻找mRNA内部Nm修饰与稳定性的关联——内部Nm修饰增加mRNA稳定性（图A）；

2. 沉默FBL和配体NOP56进行RNA-seq验证表型——没有Nm修饰，mRNA半衰期降低（图B）；

3. Nm修饰的writer蛋白FBL进行RIP-seq鉴定其结合靶标，发现FBL未结合的RNA表达水平降低（图C）；

4. Direct RNA-seq鉴定Nm修饰位点，开发Nm修饰检测软件，准确鉴定Nm修饰（图D）；

5. Nm修饰在mRNA内部主要定位在Exon和3’UTR（图E）；

6. 沉默FBL可以全局性降低mRNA的内部Nm修饰水平，差异甲基化分析发现整个转录本Nm修饰均匀下降（图F和图G）；

7. RIP-seq联合DRS的Venn图鉴定FBL调控的靶标，表达水平越高的基因，其具有Nm修饰的mRNA比例越高（图H和图I）；

8. 寻找Nm影响RNA稳定性的机制：具有Nm修饰的mRNA 3’UTR长度更短，敲低FBL后3’UTR长度变长（图J）；

Nm可能影响可变PolyA位点选择，缩短3’UTR长度，从而增加mRNA的稳定性（图K）。