Screen Quest Calbryte 520 免丙磺舒

Screen Quest Calbryte 520 免丙磺舒和免洗钙检测试剂盒是美国AAT Bioquest研发的用于检测钙离子的试剂盒钙通量测定是用于筛选G蛋白偶联受体（GPCR）的药物发现中的优选方法。 Screen Quest Calbryte-520不含Probenecid和Wash-Free的钙测定试剂盒提供强大的均相荧光测定，用于检测细胞内钙动员。表达感兴趣的GPCR的细胞通过钙预先加载我们专有的Calbryte -520NW，其可以穿过细胞膜。 Calbryte -520 NW是适合HTS筛查的钙指示剂。一旦进入细胞内，Calbryte -520NW的亲脂性阻断基团被非特异性细胞酯酶切割，导致带电荷的荧光染料停留在细胞内，并且在与钙结合后其荧光大大增强。当用筛选化合物刺激细胞时，该受体表明细胞内钙的释放，这极大地增加了Calbryte -520NW的荧光。其优异的细胞保留特性，高灵敏度和100-250倍的荧光增加（当它与钙形成复合物时）使Calbryte -520NW成为测量细胞钙的理想指标.Calbryte -520NW是钙染料不需要丙磺舒以获得更好的细胞保留。这款Screen Quest Calbryte-520不含Probenecid和Wash-Free的钙测定试剂盒提供了优化的检测方法，用于监测G蛋白偶联受体（GPCR）和钙通道与脆弱或困难的细胞系。该测定可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式进行，并且易于适应自动化。是AAT Bioquest 的中国代理商，为您提供优质的钙检测试剂盒。

分析方案

概述

1.在生长培养基中制备细胞

2.添加Calbryte 520 NW染料加载溶液（100μL/孔用于96孔板或25μL/孔用于384孔板）

3.在室温或37°C孵育15-30分钟

4.在Ex / Em = 490 / 525nm处监测荧光

注意：使用前在室温下解冻所有试剂盒组分

操作方法 

1.将20μL（Cat＃36317）或200μL（Cat＃36318和＃36319）DMSO加入到Calbryte 520 NW（组分A）的小瓶中并充分混合。

注意：20μLCalbryte 520 NW储备溶液足以用于一个平板。 如果管子密封，可以将未使用的Calbryte 520 NW储备溶液等分并在<-20℃下储存超过一个月。

注意：避光，避免反复冻融循环。

2.将9 mL HHBS（组分C，不包括在试剂盒Cat＃36319中）与1 mL 10X Pluronic F127 Plus（10X）（组分B）混合并充分混合。 

实验方案

1.将100μL/孔（96孔板）或25μL/孔（384孔板）的Calbryte 520NW染料加载溶液加入到细胞板中。

2.将染料加载板在细胞培养箱中孵育30分钟，然后将板在室温下再孵育15-30分钟。

注意：如果测定需要37°C，立即进行实验，无需进一步室温孵育。 如果细胞在室温下运行时间较长，可在室温下孵育细胞板1小时（建议孵育时间不超过2小时。）

3.用HHBS或所需缓冲液制备复合板

4.通过监测Ex / Em = 490 / 525nm处的荧光强度来进行钙通量测定。

数据分析

        从空白标准孔获得的读数（RFU）用作阴性对照。从其他标准的读数中减去该值，以获得基线校正值。 然后，绘制标准读数以获得标准曲线和方程。该等式可用于计算ATP样品。我们建议使用在线四参数物流计算器。

图1. CHO-K1细胞中内源性P2Y受体与ATP的荧光信号反应的比较。 将CHO-K1细胞以50,000个细胞/100μL/孔接种过夜，置于96孔黑色壁/透明底板中。 使用Screen Quest Calbryte 520不含Probenecid和WashFree钙测定试剂盒，FLIPR Calcium 4 Assay Kit和Fluo-4 Direct Calcium Assay试剂盒测量钙通量响应。 通过FlexStation 3添加ATP（50μL/孔）以达到指示的浓度。

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