多肽序列测序

多肽序列测序的技术原理与应用进展

 

在dànbáizhì组学研究中，准确测定多肽的氨基酸排列顺序是解析dànbáizhì结构与功能的基础环节。多肽序列测序技术通过化学或物理方法将多肽链断裂，随后对产生的片段进行质量分析，zuì终推导出完整的氨基酸序列。这项技术自Edman降解法问世以来经历了革命性发展，现代质谱技术已能实现飞摩尔级样品的快速测序，为生物标志物发现、药物研发和基础生物学研究提供了关键支撑。目前主流的多肽序列测序方法主要依赖两种技术路线：基于质谱的"自下而上"策略和基于纳米孔技术的单分子测序。前者通过串联质谱（MS/MS）将多肽离子化后碰撞诱导解离，产生的特征碎片图谱经数据库比对或从头测序算法解析；后者则利用电场驱动多肽通过生物纳米孔，通过测量电流变化识别氨基酸残基。值得注意的是，多肽序列测序的准确性受多种因素影响，包括样品纯度、离子化效率、碎裂模式选择以及算法参数设置等。具体费用需要根据实验需求和样品情况来确定。

 

质谱技术在多肽序列测序中的核心作用

 

现代质谱技术已成为多肽序列测序的黄金标准，特别是液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）平台。当多肽进入质谱仪后，首先在离子源中被电离（常用电喷雾电离ESI或基质辅助激光解吸电离MALDI），随后一级质谱测量其质荷比（m/z）。选定目标离子进入碰撞室后，通过碰撞诱导解离（CID）或高能碰撞解离（HCD）等碎裂技术产生b/y型离子系列。这些碎片离子进入二级质谱检测，形成的谱图包含反映氨基酸序列的特征峰群。对于复杂样品，液相色谱的预先分离能显著提高多肽序列测序的覆盖度。zuì新发展的电子转移解离（ETD）技术特别适合保留翻译后修饰信息的测序需求，而离子淌度分离（IMS）的引入则进一步提升了混合物的解析能力。

 

纳米孔测序技术的突破与挑战

 

新兴的纳米孔多肽序列测序技术为单分子水平分析开辟了新途径。该技术利用工程化dànbáizhì纳米孔（如α-溶血素变体）或固态纳米孔，在施加电压时记录单个多肽分子通过引起的电流阻滞信号。每个氨基酸残基因其大小、电荷和疏水性差异产生dútè的电流指纹，通过机器学习算法可解码序列信息。相比质谱方法，纳米孔测序无需复杂的样品前处理，且理论上能直接读取含非天然氨基酸的多肽序列。然而，当前技术仍面临信号分辨率不足（特别是区分相似氨基酸）、通量较低等限制。2022年Nature Methods报道的荧光辅助纳米孔测序（FRET-nanopore）通过共价标记荧光团，将电流信号与光学信号耦合，显著提高了多肽序列测序的准确性。

 

生物信息学在多肽序列测序中的关键角色

 

多肽序列测序产生的海量质谱数据需要高效的计算解析。数据库搜索算法（如SEQUEST、Mascot）将实验谱图与理论谱图库匹配，适用于已知dànbáizhì组的测序。而对于新多肽或存在突变/修饰的情况，从头测序算法（如Peaks、pNovo）通过建立碎片离子间的质量差推导序列，其准确性高度依赖谱图质量。深度学习模型如DeepNovo已展现出优于传统算法的性能，能同时处理多种碎裂方式的数据。值得注意的是，多肽序列测序结果的验证常需合成标准品进行质谱比对，或通过基因序列反向推导。近期发展的实时数据库搜索技术（如MSFragger）使大规模临床样本的高通量多肽序列测序成为可能。

 

常见问题：

 

Q1. 如何区分多肽序列测序中liàngānsuān（Leu）和异liàngānsuān（Ile）这两种同分异构体？

 

A：常规质谱技术难以区分Leu/Ile（质量差0.0364 Da），需采用电子激发解离（EED）或紫外光解离（UVPD）等特殊碎裂技术产生特征性w/z离子。zuì新研究显示，结合离子淌度分离和机器学习可达到90%以上的区分准确率。

 

Q2. 多肽序列测序中如何有效鉴定低丰度翻译后修饰？

 

A：需采用修饰特异性富集策略（如TiO2富集磷酸化肽段），结合电子转移解离（ETD）等保留修饰的碎裂方式。开发针对特定修饰的搜索参数（如可变修饰设置）并控制jiǎfā现率（FDR）至关重要。同位素biāojìdìng量技术可提高修饰肽段的检测灵敏度。