碱性磷酸酶（ALP/AKP）检测试剂盒，微板法

本试剂盒基于碱性磷酸酶（ALP/AKP）在碱性条件下催化磷酸苯二钠分解，生成游离酚和磷酸。生成的酚在碱性溶液中与4-氨基安替吡啉反应，经铁KCN氧化后生成红色醌衍生物。该红色物质在520 nm处有特征吸收峰，通过测定其吸光度，可定量检测样本中的碱性磷酸酶活力。

本产品适用于检测动物血清/浆、组织、各种体液、培养细胞以及细胞培养上清液等的碱性磷酸酶（ALP/AKP）活力。

 

产品信息

 

货号	60420ES48/60420ES59
规格	48 T/96 T
检测范围	0～60金氏单位/100 mL

组分信息

组分编号	组分名称	48 T	96 T	储存条件	备注
60420ES-A	缓冲液	3 mL×1瓶	6 mL×1瓶	2～8℃	Part1
60420ES-B	基质液	3 mL×1瓶	6 mL×1瓶	-25～-15℃避光	Part2
60420ES-C	显色剂	9 mL×1瓶	18 mL×1瓶	2～8℃避光	Part1
60420ES-D	酚标准贮备液 （1.1 mg/mL）	0.5 mL×1支	0.5 mL×1支	2～8℃避光	Part1

备注：0.1 mg/mL 酚标准应用液配制方法：1.1 mg/mL酚标准贮备液﹕蒸馏水=1﹕10 稀释，现用现配。

使用说明

1.仪器试剂准备

含490～530 nm 波长的酶标仪、96孔板、37℃水浴锅或恒温箱、台式低速离心机、移液器、蒸馏水、生理盐水（0.9%）或PBS（0.1 M）、涡旋混匀器、试管或离心管、蛋白测定试剂盒（组织及细胞样本用）。

2.样本采集与保存

按常规方法采集样本，样本可以是血清/浆、细胞培养上清、组织或培养细胞。如样本收集后不能及时检测，请将样本放置于-25～-15℃或更低温度保存。

3.血清/血浆、组织标本的碱性磷酸酶（ALP/AKP）测定步骤

1)  血清/血浆

一般可直接使用，但如鸡的血清/浆中碱性磷酸酶（ALP/AKP）活力较高，一般需要用生理盐水5倍或10倍稀释后测，其它种属可先预试后再测。

2)  组织标本

准确称取待测组织的重量，按重量（g）：体积(mL)= 1:9的比例，加入生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆，2500转/分，离心10分钟，取上清液待测（上清液需要测定其蛋白浓度）。

3）操作表

试剂	空白孔	标准孔	测定孔
双蒸水（μL）	5
0.1 mg/mL 酚标准应用液（μL）		5
待测样本（μL）			5
缓冲液（μL）	50	50	50
基质液（μL）	50	50	50
充分混匀37℃水浴15分钟
显色剂（μL）	150	150	150
轻轻振摇孔板混匀，波长520 nm，酶标仪测定各孔吸光度值（如果所用的酶标仪没有此波长，可以用相近的510 nm或者530 nm 波长均可，510 nm 波长测定结果相对530 nm更好）

4）计算公式

a.液体样本计算方式：（适用于培养液、血清、血浆等液体样本的计算）

定义：100 mL血清或液体在37℃与基质作用15分钟产生1 mg 酚为1个金氏单位。

计算公式：液体样本ALP/AKP活力（金氏单位/100 mL）=(A测定−A空白)/(A标准−A空白)×C标准×100×N

其中，A测定：表示测定孔的吸光度值；A空白：表示空白孔的吸光度值；A标准：表示标准孔的吸光度值；C标准：表示酚标准液浓度，单位为0.1 mg/mL；N：表示样本测试前的稀释倍数。

b.组织计算公式：（适用于培养细胞、组织等相关样本的计算）

定义：每克组织蛋白在37℃与基质作用15分钟产生1 mg 酚为1个金氏单位。

计算公式：组织、细胞样本ALP/AKP活力（金氏单位/gprot）=(A测定−A空白)/(A标准−A空白)×C标准÷Cpr​

其中，A测定：表示测定孔的吸光度值；A空白：表示空白孔的吸光度值；A标准：表示标准孔的吸光度值；C标准：表示酚标准液浓度，0.1 mg/mL；Cpr：表示样本蛋白浓度，单位为gprot/mL（prot指蛋白）。

4.培养液及细胞中的碱性磷酸酶（ALP/AKP）测定步骤

1）悬浮培养细胞：可直接通过离心收集沉淀细胞（1000转/分钟，离心10分钟，弃上清留沉淀细胞）。

2）贴壁培养的细胞：吸去上清，可通过细胞刮直接将细胞刮下；或者是用0.25%的胰酶室温消化2～3分钟，加培养液终止消化，用微量移液器轻轻吹打，将所有液体吸出转入EP管，然后1000转/分钟，离心10分钟弃上清，留沉淀细胞，再加入1 mL PBS轻轻吹打，再次1000 转/分钟，离心10分钟弃上清，留沉淀细胞待用。如暂时不做，则可以将细胞沉淀物低温冻存，温度越低越好。

3）培养细胞的破碎：

a.研磨破碎：在细胞沉淀中加入一定量（106的细胞一般加0.3～0.5 mL）的缓冲液（缓冲液可以用PBS或者是生理盐水），用手动玻璃匀浆器冰水浴研磨3～5分钟，或者是用卡富隆电动研磨器冰水浴研磨3分钟待测。

b.超声破碎：在细胞沉淀中加入一定量（106的细胞一般加0.3～0.5 mL）的缓冲液（缓冲液可以用PBS或者是生理盐水），需保证超声探头在液面以下。功率300W，冰水浴，每3～5秒超声一次，间隔4次，每次间隔时间为30秒左右。

c.化学裂解：贴壁培养的细胞，可直接将上清吸去后，直接在孔板或是瓶中加入一定量的裂解液（覆盖满细胞），裂解30～40分钟（可用显微镜观察细胞破碎情况），再用微量移液器吸出待测。根据需要可用生理盐水或PBS进行一定的稀释。

4）操作表

试剂	空白孔	标准孔	测定孔
双蒸水（μL）	30
0.02 mg/mL 酚标准应用液（μL）		30
待测样本（μL）			30
缓冲液（μL）	50	50	50
基质液（μL）	50	50	50
充分混匀37℃水浴15分钟
显色剂（μL）	150	150	150
轻轻振摇孔板混匀，波长520 nm，酶标仪测定各孔吸光度值（如果所用的酶标仪没有此波长，可以用相近的510 nm或者530 nm 波长均可，510 nm 波长测定结果相对530 nm更好）

注：细胞水平的ALP/AKP活性较低，所以取样量相应的加大；取样量加大的同时，为防止标准孔吸光度过大，将0.1 mg/mL标准应用液用蒸馏水再稀释5倍待测，即0.02 mg/mL。

5）计算公式

a.培养液样本ALP/AKP活力（金氏单位/100 mL）=(A测定−A空白)/(A标准−A空白)×C标准×100×N

其中：A测定：表示测定孔的吸光度值；A空白：表示空白孔的吸光度值；A标准：表示标准孔的吸光度值；C标准：表示酚标准液浓度，单位为0.02 mg/mL；N：表示样本测试前的稀释倍数。

b.细胞样本ALP/AKP活力（金氏单位/gprot）=(A测定−A空白)/(A标准−A空白)×C标准÷Cpr​

其中：A测定：表示测定孔的吸光度值；A空白：表示空白孔的吸光度值；A标准：表示标准孔的吸光度值；C标准：表示酚标准液浓度，0.02 mg/mL；Cpr：表示样本蛋白浓度，单位为gprot/mL（prot指蛋白）。

 

2～8℃避光保存，有效期6个月。