Cas14a 切割底物-ssDNA-荧光型DNA-FAM-B

诺奖得主 Jennifer 最新研究：CRISPR/Cas12c 无需切割 DNA 就可实现基因沉默，抵御病毒入侵

与 DNA 结合依赖于 pre-crRNA 的加工 上述的实验已经证明 Cas12c 不进行靶 DNA 切割，那么 Cas12c 是否能结合经由 RNA 引导的互补底物？结合筛选实验表明，Cas12c 在低纳米摩尔范围内可结合目标 dsDNA，并对部分碱基配对的 DNA 具有更强的亲和力。因此，这些数据表明，像其他 Cas12 酶和 Cas9 一样，Cas12c 也与目标 ssDNA 具有较高的结合亲和力但不能检测到与 ssRNA 结合。 图片来源：Molecular Cell Cas12c

搞定 CRISPR/Cas9 系统操作

靠近 5』端的公共部分，保证每个 isoform 都会成功移码突变 通常情况下，为了便于下游 KO mutants 的鉴定，我们往往可以作如上设计：即 Cas9 的切割位点刚好被一个酶切位点跨过，且附近至少 100 bp 内酶切位点唯一。 为了减少 Off-Target 效应，请把设计好的 Target 放在括号中的网址里去做预测，尽量找到一条脱靶效应较小的来继续下游实验。 20 nt 确定之后，请

实时定量PCR探针的合成

PCR体系。靶序列的特异性探针和特异性的PCR引物同时使用，设计的该探针在上下游PCR引物的范围内退火。在PCR的延伸阶段，Taq DNA聚合酶5’-3’的核酸外切酶活性将荧光报告基团从探针上切割下来。随着PCR循环数的增加，游离报告基团的数量不断的增加，实时检测从游离荧光基团上释放的荧光信号，从而对靶序列进行定量分析。在设计这些双标探针的时候需要谨记以下几个要点。1. 探针的结合位置很重要，先设计好探针再设计PCR引物。2. 探针的结合位点应该靠近扩增产物的中心，扩增产物的长度应该