末端脱氧核糖核酸转移酶

原位末端转移酶标记技术检测凋亡

  （一）原理   凋亡细胞是由于内源性核酸内切酶的激活后，将DNA 切割成许多双链DNA 片段以及高分子量DNA 单链断裂点（缺口），暴露出大量3- 羟基末端，如用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT ）将标记的dUTP 进行缺口末端标记，则可原位特异地显示出凋亡细胞。主要应用的是荧光标记法和酶标记法。   （二）荧光标记法   1 ．材料与试剂 采用德国Boehringer-Mannheim 公司In Situ Cell

原位末端转移酶标记技术 （ISEL）检测细胞凋亡

的3-OH末端。而TdT具有构型非特异性与3´-OH端部位的碱基结合的功能。因此，在末端脱氧核糖核酸转移酶或DNA多聚酶介导下，可使生物素化的dUTP标记至DNA断裂后形成的3´-OH末端，借生物素和亲和素的特异结合，使过氧化物酶连接至DNA断点，最后加入底物显色，可在荧光显微镜下观察，计数着色的凋亡细胞。

末端转移酶标记技术（TUNEL法）检测细胞凋亡

置于湿盒中）；同时设立对照： A）阴性对照：每一实验均应设立对照，每孔加50μl标记液（无末端转移酶）代替TUNEL反应混合物； B）阳性对照：每一实验均应设立对照，用微球核酸酶或DNA酶I处理已固定/透化的细胞（1μg～1mg/ml，室温10min），以诱导DNA链断裂。37℃孵育 30min； PBS洗3次； 单个转换和分析：标本吹干，加50μl转换POD（注意要在单层细胞上均匀分布POD，为避免蒸发，将玻片置于湿盒中）37℃ 30min，PBS洗3次，加50～100μl