博来霉素诱导肺纤维化小鼠模型

一、实验材料准备

1. 实验动物

• 品系选择：
  • C57BL/6小鼠（最常用，对BLM敏感，雄性更易形成纤维化）。
  • BALB/c小鼠（纤维化程度较轻，可用于对比研究）。
• 年龄与体重：8-12周龄，体重20-25 g（避免使用老龄鼠，除非研究年龄相关纤维化）。
• 对照组设置：
  • 生理盐水组（假手术对照）。
  • 必要时设空白对照组（未处理小鼠）。

2. 试剂与设备

试剂/设备	说明
博来霉素（BLM）	盐酸盐形式（如Sigma-Aldrich），溶解于生理盐水
生理盐水	用于稀释BLM和对照组处理
麻醉剂	异氟烷（推荐）或戊巴bi妥钠
气管插管工具	22G静脉导管/专用插管针
手术器械	眼科剪、镊子、缝合线
小动物呼吸机（可选）	提高手术安全性
无创血氧仪	监测术后缺氧情况
组织固定液	4%duo聚甲醛（用于肺组织固定）

二、模型构建步骤

1. BLM溶液配制

• 剂量选择：
  • 常用剂量：1.5–3.0 U/kg（通常2 U/kg可平衡死亡率和纤维化程度）。
  • 计算示例：
    • 若小鼠体重=25 g，BLM剂量=2 U/kg → 0.05 U/只（假设BLM原液=1 U/mL，则取50 μL）。
• 溶解方法：用生理盐水稀释至50 μL（便于气管滴注）。

2. 给药方式（3种常见方法）

（1）气管内滴注法（最经典，推荐）

步骤：

1. 麻醉小鼠：异氟烷（4%诱导，1.5–2%维持）或戊巴bi妥钠（50 mg/kg）。
2. 固定与消毒：仰卧位固定，颈部剃毛并碘伏消毒。
3. 气管暴露：
   • 沿颈部中线切开皮肤（约1 cm），分离肌肉暴露气管。
   • 在气管环间穿刺（避免穿透后壁），插入导管（22G针头）。
4. 滴注BLM：
   • 缓慢注入50 μL BLM溶液（2 U/kg），随后注入50 μL空气冲洗导管。
   • 关键操作：滴注后直立小鼠并轻摇胸部，使药物均匀分布。
5. 缝合伤口：缝合皮肤，术后保暖复苏。

优点：纤维化程度可控，重复性好。
缺点：需手术操作，死亡率约10–20%。

（2）经鼻滴注法（操作简单，但变异大）

• 步骤：
  1. 轻度麻醉小鼠（异氟烷短暂诱导）。
  2. 用移液器将BLM溶液（50 μL，2 U/kg）滴入鼻腔，利用吸气动作吸入肺部。
• 优点：无需手术，适合高通量筛选。
• 缺点：纤维化不均匀，部分小鼠可能未成功建模。

（3）雾化吸入法（更接近临床，但设备要求高）

• 步骤：
  • 将BLM溶液（5–10 U/mL）雾化，小鼠置于密闭舱吸入30–60分钟。
• 优点：无创，纤维化分布均匀。
• 缺点：需专用雾化设备，剂量难以精确控制。

三、模型评估

1. 时间节点

阶段	时间	主要特征
急性炎症期	7–14天	肺泡炎、中性粒细胞浸润
纤维化形成期	14–21天	胶原沉积、成纤维细胞活化
纤维化高峰期	28天	广泛瘢痕形成

2. 检测方法

（1）组织病理学（金标准）

• HE染色：观察炎症浸润和肺泡结构破坏。
• Masson三色染色/天狼星红染色：定量胶原沉积（纤维化标志）。
• Ashcroft评分：半定量评估纤维化程度（0–8分）。

（2）羟脯氨酸检测（胶原定量）

• 取肺组织水解后检测羟脯氨酸含量（胶原蛋白特异性指标）。

（3）肺功能检测（可选）

• 使用小动物肺功能仪测量：
  • 肺顺应性（降低）
  • 气道阻力（升高）

（4）分子标志物检测

• qPCR/WB：检测 TGF-β、α-SMA、Collagen I/III、MMP-9/TIMP-1。

四、注意事项

1. 剂量优化

• 低剂量（1–1.5 U/kg）：纤维化较轻，适合药物干预研究。
• 高剂量（3 U/kg）：纤维化明显，但死亡率可能达30%。

2. 减少死亡率

• 术后24小时内补充氧气（氧舱放置1小时）。
• 避免麻醉过深（异氟烷优于戊巴bi妥钠）。

3. 对照组设置

• 生理盐水组：同体积气管滴注。
• 空白对照组：未处理小鼠（评估手术本身的影响）。

4. 伦理终点

• 若小鼠体重下降＞20%或出现严重呼吸困难，需提前安乐si。

五、常见问题与解决方案

问题	可能原因	解决方案
死亡率高	BLM剂量过高/麻醉过深	降低剂量至1.5 U/kg，改用异氟烷麻醉
纤维化不均匀	气管滴注分布不均	滴注后直立小鼠并轻摇胸部
炎症过强但纤维化弱	观察时间不足（<14天）	延长至21–28天