圆二色谱生物大分子表征实验服务

圆二色谱生物大分子表征实验服务

1.原理

圆二色谱由于对左右旋圆偏振光的吸光率 (εl (λ)，εr (λ)) 不同，产生一个差值 ∆ε (λ)=εl (λ)–εr (λ)，使得左右旋圆偏振光通过介质后振幅也将不同，这样两者叠加而形成椭圆偏振光。CD谱通过测量生物分子对左、右圆偏振光的吸收差异（称为圆二色性），进而揭示分子的结构和构象信息（如图1）。

图1 圆二色谱原理图

圆二色谱谱图分析技术是一种通过测量蛋白质对不同波长的圆偏振光的吸收和散射来分析其构象的方法。圆二色谱谱图可以提供关于蛋白质二级结构、折叠状态和相互作用等信息（如图2）。通过分析圆二色谱谱图，我们可以了解蛋白质的构象特征，从而深入研究其功能和相互作用机制。

蛋白质的二级结构在CD谱紫外区段（180-260 nm）有明显的信号，主要生色团是肽链，这一波长范围的 CD谱包含了生物大分子主链构象的信息。如图1所示，α-螺旋构象的CD谱在222 nm、208 nm处呈负峰，在192 nm附近有一正峰。β-折叠构象的CD谱在217-218 nm处有一负峰，在185-200 nm处有一强的正峰。β-转角在220-230 nm有一负带，在205 nm有一正带。P2结构的CD谱在205 nm附近有一负峰，在220 nm附近有一正峰。无规则卷曲构象的CD谱在200 nm附近有一负峰，在218 nm附近有一小而宽的正峰 (见表1)。

图2 蛋白不同空间构象的CD谱曲线

表1 蛋白质的二级结构CD图谱分析

2.样品准备

圆二色谱分析的供试品，大多数情况下是蛋白质和多肽。

> 蛋白质的精确浓度是计算样品二级结构的关键，样品必须保持一定的纯度，不含光吸收的杂质，溶剂须对样品的测定波长没有吸收干扰。

> 样品能完全溶解在溶剂中, 形成均一透明的溶液。

> 样品浓度通常为0.1-0.3 mg/mL，比如单抗样品0.2 mg/mL，样品纯度要在90%以上。

> 缓冲buffer，一般选择PBS溶液(不含NaCl)、2 mM HEPES等，其中氯离子对圆二色性影响比较大，所以Tris缓冲液是不能用来做CD实验。

 

案例一 检测蛋白质的二级结构

BSA的二级结构

案例二 蛋白质与小分子的相互作用

CuB 与 IGF2BP1 结合导致IGF2BP1 的二级结构 (α 螺旋) 发生改变